III Международный конкурс
научно-исследовательских и творческих работ учащихся
«СТАРТ В НАУКЕ»
 
     

КУЛЬТИВИРОВАНИЕ МИКРОВОДОРОСЛЕЙ ISOCHRYSIS GALBANA И CHLORELLA SP. ПРИ ИСПОЛЬЗОВАНИИ РАЗЛИЧНЫХ ЛЮМИНЕСЦЕНТНЫХ ЛАМП: ЛД – 40, OSRAM FLUORA L 18W/77 И SYLVANIA CORALSTAR
Кваша А.В.
Автор работы награжден дипломом победителя первой степени
Диплом школьника      Диплом руководителя
Текст научной работы размещён без изображений и формул.
Полная версия научной работы доступна в формате PDF


Введение

Проблема кормов относится к числу важнейших проблем морской аквакультуры. При выращивании водных животных в искусственных условиях используемые корма должны полностью удовлетворять потребности организма рыб или беспозвоночных в питательных веществах (белках, жирах и углеводах), минеральных солях, микроэлементах и витаминах. На разных этапах развития гидробионтов пища должна быть соответствующего размера и формы [3]. Особенно остро в аквариумистике стоит вопрос о кормлении мальков рыб и мелких беспозвоночных животных. Например, кораллы, у которых нет симбиотических водорослей зооксантелл, должны получать корм извне, а поскольку в аквариумах обычно развивается небольшое количество фито- и зоопланктона, то в отсутствие дополнительного корма они находятся в угнетенном состоянии (рис.1, А и Б). Для поддержания нормального, здорового состояния коралла, его нужно кормить искусственно минимум раз в неделю [1, 2].

Рисунок 1. А) Голодная и очень слабая тубастрея в отсаднике на откорме.

Б) Сильная сытая тубастрея на постоянном месте в аквариуме.

Еще одна проблема – это выращивание мальков, в частности их выкармливание. Важным этапом в жизни многих водных животных становится переход к самостоятельному питанию. Оказывается, что рыбы и ракообразные особенно требовательны к кормам именно на ранних этапах онтогенеза. Установлено, что для нормального развития и оптимального роста личинок и молоди культивируемых гидробионтов предпочтительны живые корма. В морской аквакультуре используются те кормовые организмы, которые можно выращивать в необходимом количестве в искусственных условиях [3].

Рисунок 2. Использование микроводорослей в аквакультуре

В природе существует большое разнообразие зоопланктонных организмов, которые по размерам подходят в качестве корма для личинок рыб и беспозвоночных. В рыбоводстве делались попытки использовать в качестве корма зоопланктон, обитающий в естественных условиях. К недостаткам этого способа относятся неравномерность распределения зоопланктона, временные флуктуации численности, наличие форм неподходящего размера, а также нежелательных видов, которые могут оказаться хищниками или конкурировать с культивируемыми организмами. В связи с этим, если в качестве корма используется зоопланктон, его выращивают в монокультуре [7]. Многие исследователи считают, что культивирование зоопланктона как корма для морских гидробионтов необходимо проводить на одноклеточных микроводорослях (рис.2). Одноклеточные водоросли удовлетворяют требованиям массового культивирования зоопланктонных организмов по множественным параметрам. В отличие, например, от дрожжей, они: 1) более питательны, и зоопланктон, питающийся ими, соответствует по биохимическому составу потребностям личинкам морских рыб и беспозвоночных для нормального роста и развития (табл. 1); 2) находятся в толще воды в подвижном состоянии, а не оседают на дно; 3) улучшают гидрохимический фон среды, включая в свой метаболизм отходы жизнедеятельности организмов в форме как неорганических, так и органических соединений [18].

Таблица 1

Максимальное содержание (% от сухого веса) белка, углеводов, липидов в кормовых микроводорослях и их суммарная калорийность (ккал/г СВ).

Вид водорослей

Белок

Углеводы

Липиды

Суммарная калорийность

Isochrysis galbana [18]

49,8

28,4

25,6

6,24

Chlorella sp.[8]

40 - 55

35,0

5 - 10

4,15

В Севастопольском морском Аквариуме-музее, на базе которого проводились исследования, огромное количество гидробионтов, содержащихся в искусственных экосистемах. Это не только рыбы, но и многие представители беспозвоночных. В связи с потребностью обеспечения их качественным живым кормом, возникла необходимость культивирования микроводорослей. В научной литературе, посвященной данной теме, для массового культивирования микроводорослей используются люминесцентные лампы ЛД – 40 [19], в то время как на рынке появились и активно рекламируются специальные люминесцентные лампы, способствующие ускоренному росту растений - OSRAM FLUORA L 18W/77. Для подсветки океанических аквариумов часто используется специальная лампа SYLVANIA Coralstar, которую тоже решено было включить в эксперимент – дело в том, что некоторые морские организмы — в частности, актинии, кораллы и тридакны, содержат в своих тканях одноклеточные симбиотические водоросли (зооксантеллы). Эти водоросли существуют за счёт фотосинтеза и требуют хорошего освещения (в настоящее время термин «зооксантеллы» является устаревшим, в современной классификации — Symbiodinium) [6]. Виды Symbiodinium sp. обладают очень важным свойством, а именно, способностью к фотосинтезу. Для роста кораллов, несущих в своих тканях представителей Symbiodinium, требуется свет, потому что питательные вещества, полученные в результате фотосинтеза, необходимы не только для жизнедеятельности зооксантелл, но и для поддержания энергоемкого процесса кальцификации (построения скелета) самих кораллов [17]. Именно поэтому было интересно, как реагируют микроводоросли на подсветку лампой SYLVANIA Coralstar.

Таким образом, была определена цель исследования: изучить продукционные характеристики двух культур микроводорослей Isochrysis galbana, Chlorella sp. при подсветке их различными люминесцентными лампами, обычно используемыми в аквариумистике: ЛД – 40, OSRAM FLUORA L 18W/77 и SYLVANIA Coralstar. Для достижения поставленной цели следовало решить ряд задач:

  1. Ознакомиться с литературой по теме исследования;

  2. Изучить теоретические основы культивирования микроводорослей;

  3. Подготовить посуду и необходимое оборудование;

  4. Освоить микроскопию с использованием микроскопа БИОЛАМ;

  5. Приготовить среду Уолна для культивирования микроводорослей;

  6. Освоить методы подсчета микроводорослей;

  7. Произвести посев микроводорослей в подготовленную среду;

  8. Вести ежедневный подсчет количества клеток водорослей в накопительной культуре;

  9. Свести все полученные данные в таблицы, произвести необходимые расчеты, построить графики;

  10. Сделать выводы.

Основная часть

Материалы и методы

В экспериментальных исследованиях были использованы следующие микроводоросли (табл. 2) [15]:

Таблица 2

Размерные характеристики и объемы клеток микроводорослей

Вид микроводорослей

Длина клетки (мкм)

Объем клетки (мкм3)

Класс

Isochrysis galbana

3 – 5

39,19

Prymnesiophyceae

Chlorella sp.

2 – 4

14,14

Trebouxiophyceae

Источником моновидовых накопительных культур этих микроводорослей служили линии микроводорослей, выращенные группой культивирования рыб отдела аквакультуры и морской фармакологии ИМБИ РАН, исходно полученные из музея-коллекции живых культур морских микроводорослей ИМБИ РАН (ранее ИнБЮМ).

Isochrysis galbana – золотистая микроводоросль. Клетки сферические подвижные, с двумя равными жгутиками [19].

Chlorella sp.- микроскопическая зеленая водоросль [11].

Рисунок 3. Схема подготовки питательной среды и массового культивирования микроводорослей.

Использованные в экспериментах микроводоросли выращивали в накопительном режиме на основе стерилизованной черноморской воды обогащенной средой Уолна [12], при температуре 23 ± 1.5ºС (рис. 3). Круглосуточное освещение интенсивностью 900 lux осуществляли с помощью люминесцентных ламп: ЛД – 40, OSRAM FLUORA L 18W/77 и SYLVANIA Coralstar (рис. 4, А и Б).

Рисунок 4. Подсветка опытных емкостей с культурам микроводорослей

А) лампа ЛД-40 и SYLVANIA Coralstar Б) лампа OSRAM FLUORA L18W/77

Определение плотности (численности) клеток водорослей методом прямого подсчета в камере Горяева [13]. Содержимое колбы с водорослями перемешивали вручную, затем пипеткой отбирали суспензию водорослей (аликвоту) и наносили по одной капле на верхнюю и нижнюю части сетки счетной камеры Горяева. Затем камеру накрывали покровным стеклом, которое притирали по бокам до появления колец интерференции. Капли суспензии водорослей наносили не подряд из одной пипетки, а при двукратном взятии суспензии в пипетку из одной и той же колбы.Через 1-2 мин после оседания клеток водорослей камеру Горяева помещали под объектив бинокулярного микроскопа БИОЛАМ ЛОМО с фазовым контрастом КФ-4 и подсчитывали количество клеток водорослей во всех 25 больших квадратах сетки (рис. 5).

Плотность (численность) клеток водорослей в 1 см суспензии водорослей рассчитывали по формуле:

,

где m – суммарное количество клеток водорослей в учтенных больших квадратах сетки; 104 – коэффициент пересчета кубических миллиметров в кубические сантиметры.Плотность (численность) клеток водорослей подсчитывают в каждой колбе, отбирая по две аликвоты.

Рисунок 5. Подсчет численности клеток микроводорослей методом прямой микроскопии с фазовым контрастом

Биомасса водорослей. Принимая удельный вес клетки пресноводных и солоноватоводных видов равным единице, биомассу водорослей вычисляли по формуле [5]:

(мкг/мл), где

– биомасса, – объем клетки, ρ – удельный вес

Удельную скорость роста (μср.) за определенный промежуток времени определяли по формуле:

(сут-1), где

X1 и X0 – биомасса организмов соответственно в начале и конце роста;

t1 – t0– время роста [4, 5].

Люминесцентные лампы, использованные в эксперименте и их характеристики

Рисунок 6. Влияние длины волны на развитие растения

На рисунке 6 представлены пики фотосинтеза и синтеза хлорофилла, которые приходятся на длины волн 445 нм и 660 нм [16].

Лампа ЛД-40 – «белая»

Лампы люминесцентные серии ЛД - лампы люминесцентные низкого давления (рис. 7). Все люминесцентные лампы отличаются повышенной световой отдачей, небольшим потреблением энергии и очень длительным сроком службы [9].

Рисунок 7. График спектрального распределения светового потока люминесцентной лампы ЛД-40 («белая»)

FLUORA L 18W/77 (T8) – «розовая»

Люминесцентная трубчатая лампа FLUORA L 18W/77 (T8) идеальна для подсветки растений и аквариумов [20]. Благодаря увеличенной доли красного и синего спектрального излучения лампы, позволяет обеспечить фотобиологические процессы (фотосинтез и фотоморфогенез), способствующие ускоренному росту растений (рис. 8). Использование в аквариуме данной лампы позволяет значительно ускорить рост, улучшить окраску и форму аквариумных растений.

Рисунок 8. График спектрального распределения светового потока люминесцентной лампы FLUORA L 18W/77 (T8) («розовая»)

SYLVANIA Coralstar – «голубая»

SYLVANIA Coralstar — люминесцентные лампы для подсветки морских аквариумов, создающие естественные условия освещения как на коралловом рифе при глубине 6 -10 м посредством актинического синего излучения (рис. 9). Способствуют росту кораллов и беспозвоночных животных. Подчеркивают естественный цвет кораллов. Лампы SYLVANIA Coralstar применяются для освещения кораллов и беспозвоночных животных в аквариумах с морской водой [10].

Рисунок 9. График спектрального распределения светового потока люминесцентной лампы SYLVANIA Coralstar («голубая»)

Обсуждение полученных результатов

Наиболее энергосберегающий способ культивирования микроводорослей - накопительный - широко применяется в марикультуре из-за простоты и гибкости в обращении [15].

В первый день эксперимента была произведена инокуляция клеток 2 культур микроводорослей Isochrysis galbana иChlorella sp. в емкости, содержащие стерильную морскую воду и питательную среду. Далее, мы наблюдали рост культур и просчитывали численность микроводорослей (рис. 10).

Рисунок 10. Динамика численности микроводоросли Isochrysis galbana в накопительной культуре при освещении различными люминесцентными лампами.

Из рисунка 7 видно, что за время эксперимента Isochrysis galbana максимальных значений численности достигла при освещении лампами ЛД – 40 «белая» и FLUORA L 18W/77 (T8) «розовая»: 40,8 · 106 кл/мл и 40,2· 106 кл/мл, соответственно. Численность клеток при освещении опытных емкостей люминесцентной лампой SYLVANIA Coralstar была значительно ниже, и составила 22,5· 106 кл/мл.

Рисунок 11. Динамика численности микроводоросли Chlorella sp. в накопительной культуре при освещении различными люминесцентными лампами.

Практически такую же картину мы наблюдали в экспериментальных емкостях с Chlorella sp. (рис. 11): максимальных значений численность ее достигала при освещении лампами ЛД – 40 «белая» - 51,4 · 106 кл/мл и FLUORA L 18W/77 (T8) «розовая» - 50,9 · 106 кл/мл, соответственно. Численность клеток при освещении опытных емкостей люминесцентной лампой SYLVANIA Coralstar составила 36,8· 106 кл/мл, что существенно ниже.

Рассчитанные значения средней удельной скорости роста микроводорослей представлены на рисунках 12 и 13.

Рисунок 12. Средняя удельная скорость роста микроводоросли Isochrysis galbana за время эксперимента, сут-1

Рисунок 13. Средняя удельная скорость роста микроводоросли Chlorella sp. за время эксперимента, сут-1

Максимальные удельные скорости роста клеток были отмечены в накопительных культурах микроводорослей при освещении опытных емкостей «белой» и «розовой» лампами и составили: у Isochrysis galbana 1,47 сут-1, а у Chlorella sp. хотя полученные значения и были ниже - 0,68 – 0,69 сут-1 у «белой» и «розовой» лампсоответственно, но тенденция явно такая же, как и в опыте с Isochrysis galbana.

Выводы

Целью исследования было изучение продукционных характеристик двух культур микроводорослей Isochrysis galbana, Chlorella sp. при подсветке их различными люминесцентными лампами, обычно используемыми в аквариумистике: ЛД – 40, OSRAM FLUORA L 18W/77 и SYLVANIA Coralstar. В результате исследования мы пришли к следующим выводам:

  1. Люминесцентные лампы ЛД-40 «белые» при культивировании микроводорослей могут быть использованы наравне с FLUORA L 18W/77 (T8) «розовые» - их спектральные характеристики схожи между собой. За время эксперимента (5 суток) были получены очень близкие результаты для культуры микроводоросли Isochrysis galbana, подсвеченной «белой» и «розовой» лампами. Их численности достигли значений 40,8 · 106 кл/мл и 40,2· 106 кл/мл, соответственно.

Аналогичные результаты получены и для микроводоросли Chlorella sp., подсвеченнойэтими же лампами: «белая» - 51,4 · 106 кл/мл и FLUORA L 18W/77 (T8) «розовая» - 50,9 · 106 кл/мл, соответственно.

  1. Средние удельные скорости роста показали ту же тенденцию: у Isochrysis galbana этот показатель составил 1,47 сут-1 при подсветке «белой» и «розовой» лампами, а для Chlorella sp. он составил0,68 и 0,69 сут-1 у «белой» и «розовой» лампсоответственно.

  2. Численность клеток при освещении опытных емкостей люминесцентной лампой SYLVANIA Coralstar была значительно ниже, чем в опытных емкостях, подсвеченных «белой» и «розовой» лампами и составила 22,5· 106 кл/мл в культуре микроводоросли Isochrysis galbana и 36,8· 106 кл/мл в культуре микроводоросли Chlorella sp. Рассчитанная средняя удельная скорость роста в этом случае тоже отличалась в меньшую сторону и составила 0,78 сут-1 в культуре микроводоросли Isochrysis galbana и 0,55 сут-1 в культуре микроводоросли Chlorella sp.

  3. Люминесцентные лампы SYLVANIA Coralstar могут быть рекомендованы для подсветки океанических аквариумов, в которых содержаться рыбы и такие беспозвоночные, как кораллы, актинии и тридакны,– основная часть спектра этих ламп лежит в «синем» диапазоне и они излучают сине-фиолетовый свет в волновом диапазоне 400 nm, который особенно благоприятен для фотосинтетического роста кораллов и беспозвоночных животных [14]. К тому же такая лампа будет препятствовать росту и развитию нежелательных микроводорослей. Она также идеально подходит для использования в глубоких рифовых аквариумах. Для культивирования микроводорослей эти лампы не подходят.

  4. При выборе люминесцентной лампы между «белой» ЛД-40 и «розовой» FLUORA L 18W/77 (T8) следует учитывать, что при прочих равных, стоимость их отличается в разы: цена «белой» лампы – от 20 до 50 рублей, в то время как «розовая» лампа стоит от 699 до 899 рублей.

Список использованных источников и литературы

  1. Акропора – морской коралл. Условия выращивания коралла Акропора в аквариуме. http://domznaniy.info/akropora-morskoj-korall.html.

  2. Безрук А.Кормление кораллов http://aqualog.ru/topic/5533-kormlenie-korallov/.

  3. Виноградов А. К. Как пополнить кладовые Нептуна! - М.: «Пищевая промышленность», 1978. – 208 с.

  4. Галковская Г. А. Эколого-биологические основы массового культивирования коловраток / Г. А. Галковская, И. Ф. Митянина, В. А. Головчиц. – Минск: Наука и техника, 1988. - 143 с.

  5. Заика В. Е. Сравнительная продуктивность гидробионтов / В. Е. Заика; АН УССР, Ин-т биологии юж. морей им. А. О. Ковалевского. – К. : Наук. думка, 1983. – 208 с.

  6. Зооксантелла https://www.aquawiki.ru/Зооксантеллы

  7. Культивирование зоопланктона http://fish-industry.ru/t_akvakultura/2363-kultivirovanie-zooplanktona-chast-1.html

  8. Куницын М.В. Хлорелла – будущее птицеводства / Журнал «Птицеводство», №4, М: ООО «Авиан», 2009. – С. 11 – 13.

  9. Лампа ЛД-40. Характеристики http://energ2010.ru/Katalog_oborudovaniya/ Lampy/Lampa_LD_40.html

  10. Лампы для аквариумов и террариумов http://www.lampa28.ru/sylvania/ CoralStar.htm

  11. Маллаалиева А. Хлорелла - это... Водоросль хлорелла http://fb.ru/article/239139/hlorella.

  12. Микулин А.Е. Живые корма. М: "Дельфин", 1994. - 104 с.

  13. Национальный стандарт Российской Федерации. Вода - ГОСТ Р 54496-2011.

  14. Освещение аквариума http://the-light.ru/osveschenie-akvariuma

  15. Рауэн Т.В. Дисс. на соискание науч. степени канд. биол. наук. Взаимодействие живых компонентов в системе искусственного воспроизводства черноморского калкана. – Севастополь, ИнБЮМ им А.О. Ковалевского, 2014. – 130 с.

  16. Свет для растений http://svetisad.ru

  17. Тим Уиджгерде. Зооксантеллы: биология и научное исследование https://reefcentral.ru/articles/0/8592/

  18. Ханайченко А. Н. Питание и продуцирование коловраток в экспериментальных популяциях при комбинированном воздействии температуры и трофических условий (на примере Brachionus plicatilis Muller, 1786): автореф. дис. на соискание науч. степени канд. биол. наук: спец. 03.00.17 «Гидробиология» / А. Н. Ханайченко. – Минск; Севастополь, 1988. – 24 с.

  19. Холодов В.И., Пиркова А.В., Ладыгина Л.В. Выращивание мидий и устриц в Черном море / под. ред. В.Н. Еремеева; Национальная академия наук Украины, Институт биологии южных морей им. А.О. Ковалевского. – Севастополь, 2010. - 422 с.

  20. Электротехника. Автоматика http://www.elaut.ru/shop/UID_464.html