III Международный конкурс
научно-исследовательских и творческих работ учащихся
«СТАРТ В НАУКЕ»
 
     

ПОЛУЧЕНИЕ ДНК В УСЛОВИЯХ ШКОЛЬНОЙ ЛАБОРАТОРИИ
Рубцов А.О.
Автор работы награжден дипломом победителя второй степени
Диплом школьника      Диплом руководителя
Текст научной работы размещён без изображений и формул.
Полная версия научной работы доступна в формате PDF


 

ВВЕДЕНИЕ

Из года в год изучение биологии в школе начинается с рассмотрения строения клетки. Большое внимание уделяется эукариотическим клеткам, содержащим в себе ядро. Функцией ядра является хранение наследственной информации. Эту информацию несут молекулы ДНК, которые содержаться в хромосомах [1]. Школьникам даже демонстрируют строение той самой ДНК. Но воображению не поддаётся представление о наличии ДНК в клетке. Действительно ли, что почти любая клетка живого организма содержит в себе молекулы ДНК?! Как много ДНК в клетках? Можно ли увидеть ДНК в реальности? Существует несколько методик получения ДНК, но для всех их выделяют определённые обязательные условия. Это использование буферного раствора, детергента и наличие спирта высокой концентрации [2].

Для большей наглядности, и для того, чтобы попробовать изучить молекулу ДНК под микроскопом, появляется ещё одна задача: окрасить полученные молекулы.

Таким образом, целью работы было получение ДНК из различных растительных и животных клеток в условиях школьной лаборатории.

Задачи исследования:

1. Используя различные литературные источники, выяснить строение ДНК.

2. Выделить ДНК из различных биологических объектов.

3. Сравнить результаты выделения ДНК по различным методикам.

4. Определить лучший детергент для выделения ДНК.

5. Окрасить молекулы ДНК.

Объект исследования: ДНК растительного и животного происхождения.

Предмет исследования: методы получения ДНК.

Глава 1. Литературный обзор

1.1 Строение и функции ДНК

Молекулы ДНК состоят из мономеров – нуклеотидов, каждый из которых содержит остаток фосфорной кислоты, сахар – дезоксирибозу и одно из четырёх азотистых оснований – аденин (А), гуанин (Г), тимин (Т), цитозин (Ц) (рис. 1).

Рис. 1. Строение нуклеотидов.

ДНК состоит из двух цепей (кроме некоторых вирусов, содержащих одноцепочечную ДНК), ориентированных азотистыми основаниями друг к другу по правилу комплементарности (рис. 2). Эта двухцепочечная молекула закручена по винтовой линии. В целом структура молекулы ДНК получила традиционное, но ошибочное название «двойной спирали», на самом же деле она является «двойным винтом» [5].

Рис. 2. Расположение азотистых оснований по правилу комплементарности.

ДНК может повреждаться разнообразными мутагенами, к которым относятся окисляющие вещества, а также высокоэнергетическая электромагнитная радиация - ультрафиолетовое и рентгеновское излучение. ДНК — полимер, мономерами которой являются дезоксирибонуклеотиды. Модель пространственного строения молекулы ДНК в виде двойной спирали была предложена в 1953 ᴦ. Дж. Уотсоном и Ф. Криком (рис. 3) [3].

Рис. 3. Джеймс Уотсон (слева) и Фрэнсис Крик (справа).

Диаметр двойной спирали ДНК - 2 нм, расстояние между соседними нуклеотидами - 0,34 нм, на один оборот спирали приходится 10 пар нуклеотидов. Длина молекулы может достигать нескольких сантиметров. Молекулярный вес - десятки и сотни миллионов. Суммарная длина ДНК ядра клетки человека - около 2 м. В эукариотических клетках ДНК образует комплексы с белками, получившие названия хроматин, которые образуют хромосомы.

Функция ДНК состоит в том, что она хранит генетическую информацию, которая используется для кодирования структуры всех белков и всех видов РНК каждого вида организма, регулирует клеточный и тканевый биосинтез компонентов и обеспечивает индивидуальность каждого организма.

В итоге ДНК хранится в хромосоме, а хромосома в клеточном ядре. Хромосома - это комплекс ДНК и хроматина [4].

1.2 Вещества, необходимые для извлечения ДНК из ядра клетки

Детергент (лат. detergeo — «стираю») — вещество или смесь, помогающее отмывать что-либо от грязи, моющее средство. Наиболее распространены три вида смесей-детергентов: мыло, стиральный порошок и шампуни.

Поверхностно-активные вещества, то есть вещества, уменьшающие поверхностное натяжение воды и способствующие тем самым проникновению воды в поры и между волокнами.

Энзимы, то есть биологические ферменты, переваривающие белковые загрязнения.

Буферные растворы (англ. buffer, от buff — смягчать удар) — растворы с определённой устойчивой концентрацией водородных ионов. рН буферных растворов мало изменяется при прибавлении к ним небольших количеств сильного основания или сильной кислоты, а также при разбавлении и концентрировании. Буферные растворы сохраняют своё действие только до определённого количества добавляемой кислоты, основания или степени разбавления, что связано с изменением концентраций его компонентов.

Способность буферного раствора сохранять свой pH определяется её буферной ёмкостью — в г-экв. сильной кислоты или основания, которые следует прибавить к 1 л буферного раствора, чтобы его pH изменился на единицу. Буферная ёмкость тем выше, чем больше концентрация его компонентов [1].

Глава II. Объекты и методы исследования

2.1 Объекты исследования

Объектами исследования являлись биологические объекты растительного и животного происхождения, а именно: яблоки, бананы, зелёный горошек, лук, томаты, клетки слизистой оболочки полости рта.

2.2 Методика получения ДНК с использованием жидкого моющего средства «AOS» в качестве детергента

Фрукты и овощи тщательно измельчали до однородного состояния с помощью блендера (рис. 4). К 5 мл полученной смеси добавляли 10 мл холодного буферного раствора и 5 мл вещества, разрушающего клеточные стенки (детергент) [5].

Рис. 4. Измельчение овощей и фруктов.

Для приготовления буферного раствора в стеклянный химический стакан наливали 120 мл дистиллированной воды, добавляли 1,5 г хлорида натрия и 5 г гидрокарбоната натрия [1]. В качестве детергента использовали моющее средство «AOS» (рис. 5). После чего, полученную смесь перемешивали примерно в течение 3 минут.

Рис. 5. Приготовление смеси буферного раствора с детергентом.

После разрушения клеточных стенок, полученный раствор, содержащий ДНК, отфильтровывали через марлю. Далее к фильтрату по стенке сосуда под острым углом приливали охлаждённый на морозе 95% этиловый спирт [5].

2.3 Методика получения ДНК с использованием пищеварительного ферментного средства «Панкреатин» в качестве детергента

Фрукты и овощи тщательно измельчали до однородного состояния с помощью блендера. К 5 мл полученной кашицы добавляли 10 мл холодного буферного раствора и 5 мл вещества, разрушающего клеточные стенки (детергент).

Для приготовления буферного раствора в стеклянный химический стакан наливали 120 мл дистиллированной воды, добавляли 1,5 г хлорида натрия и 5 г гидрокарбоната натрия. В качестве детергента использовали пищеварительное ферментное средство «Панкреатин». После чего, полученную смесь перемешивали примерно в течение 3 минут.

После разрушения клеточных стенок, полученный раствор, содержащий ДНК, отфильтровывали через марлю. Далее к фильтрату по стенке сосуда под острым углом приливали охлаждённый на морозе 95% этиловый спирт [5].

2.4 Методика получения ДНК клеток слизистой поверхности щёк

Чтобы получить клетки слизистой полости рта, необходимо пожевать щёки в течение 30 секунд (до крови жевать не нужно). Затем набрать в рот примерно 3 мл воды, прополоскать рот и выплюнуть всё содержимое в пробирку.

К полученному раствору доливали такое же количество буферного раствора и мешали в течение двух минут. Буферный раствор разрушает клеточные мембраны и ДНК высвобождается в водный раствор. К полученному раствору доливали такое же количество буферного раствора в трёх вариантах: 1) с моющим средством AOS; 2) с пищеварительным средством Панкреатин; 3) с AOS и с Панкреатином (рис. 6). Далее перемешивал все это в течение нескольких минут. После того как ДНК высвободится, пробирки помещали в стакан с тёплой водой на 10 минут и перемешивали. К нагретому раствору прибавлял охлаждённый этиловый спирт. Пробирку необходимо обязательно держать под острым углом, чтобы не произошло смешивания водной и спиртовой фазы [2].

Рис. 6. Буферные растворы с различными детергентами.

2.5 Окрашивание полученных молекул ДНК

Для окрашивания молекул ДНК использовали пищевые красители и малахитовый зелёный для аквариумных рыбок. Были апробированы две методики окрашивания: добавление растворов красителей к уже выделенным молекулам ДНК и добавление красителей в спирт, который затем приливали к раствору ещё не выделенной ДНК. Красители разводили в спирте и отфильтровывали (рис. 7).

Рис. 12. Фильтрование окрашенного спирта.

Глава III. Результаты и их обсуждения

3.1 Результаты получения ДНК с использованием жидкого моющего средства «AOS» и пищеварительного ферментного средства «Панкреатин» в качестве детергентов

После добавления детергента и тщательного перемешивания был готов раствор, содержащий пока что невидимую ДНК. Его отфильтровали через марлю и прилили охлаждённый этиловый спирт. В результате, на поверхности раздела двух жидкостей моментально начинали образовываться нити ДНК, между которыми были видны пузырьки воздуха. Постепенно молекул ДНК становилось больше и они поднимались вверх (рис. 8).

Рис. 8. Образование молекул ДНК.

Если ДНК в раствор выделилось большое количество, то она образует клубок и всплывает на поверхность (рис. 9).

Рис. 9. Образование большого количества ДНК.

Далее проводили сравнение полученных объёмов и состояний молекул ДНК при добавлении различных детергентов. При получении молекул ДНК яблока, выяснилось, что равномерное и чёткое получение молекул происходит при разрушении клеточных мембран моющим средством «AOS» (рис. 10. А). При использовании в качестве детергента «Панкреатина» образовался большой клубок ДНК, который, скорее всего, включает в себя ещё и белки (рис. 10. Б).

А. Б.

Рис. 10. Получение ДНК яблока. А. Детергент AOS. Б. Детергент «Панкреатин»

При получении ДНК банана выяснилось, что лучше для этого использовать моющее средство «AOS». При добавлении «AOS» выделились длинные нити ДНК по стенке сосуда, которые по своей структуре явно отличались от ДНК яблока (рис. 11. А). При добавлении «Панкреатина» образовался непонятный комок, который не отражал наличия в нем ДНК (рис. 11. Б).

А. Б.

Рис. 11. Получение ДНК банана. А. Детергент AOS. Б. Детергент «Панкреатин»

При получении ДНК томата, обнаружили, что при добавлении моющего средства «AOS» на поверхности раздела двух фаз образуются нити ДНК (рис. 12. А), а при добавлении «Панкреатина» не видно этих двух фаз, ДНК если и есть, то его очень сложно рассмотреть (рис. 12. Б). Получается не совсем наглядная модель.

А. Б.

Рис. 12. Получение ДНК томата. А. Детергент AOS. Б. Детергент «Панкреатин»

Лук проявил себя как не очень наглядный объект для получения ДНК. При добавлении «AOS» образовался клубок, который сразу же поднялся вверх (рис. 13. А). При добавлении «Панкреатина» выделения ДНК замечено не было (рис. 13. Б).

А. Б.

Рис. 13. Получение ДНК лука. А. Детергент AOS. Б. Детергент «Панкреатин»

А. Б.

Рис. 14. ДНК гороха. Вид сбоку: А. Детергент – «Панкреатин». Б. Детергент – «AOS».

При использовании гороха как объекта для получения ДНК, было выяснено, что при использовании обоих детергентов прослеживается великолепный результат: ДНК белым облаком из нитей образуется на поверхности раздела фаз (рис. 14). Если посмотреть сверху на полученные ДНК, то можно увидеть множество нитей (рис. 15).

А. Б.

Рис. 15. ДНК гороха. Вид сверху: А. Детергент – «Панкреатин». Б. Детергент – «AOS».

3.2 Методика получения ДНК клеток слизистой поверхности щёк

При добавлении к полученному раствору ДНК буферного раствора с моющим средством AOS раздел фаз был еле заметен, и ДНК выделилось малое количество (рис. 16. А).

При добавлении к полученному раствору ДНК буферного раствора с пищеварительным средством «Панкреатин» произошло заметное разделение фаз и образование большого количества ДНК (рис. 16. Б).

При использовании буферного раствора с AOS и Панкреатином также произошло большое выделение ДНК (рис. 16. В).

А. Б. В.

Рис. 16. ДНК клеток слизистой поверхности щёк человека. А. Детергент – «AOS». Б. Детергент – «Панкреатин». В. Детергент – «AOS» и «Панкреатин».

Полученные молекулы ДНК с помощью пипетки перенесли на предметное стекло и рассмотрели под объективом школьного микроскопа. Увиденное шокировало! В окуляр микроскопа была видна нитевидная молекула (рис. 17).

Рис. 17. ДНК эпителиальных клеток человека. Вид в микроскоп.

Для того, чтобы рассмотреть ДНК получше, её сфотографировали и фотографию увеличили в несколько раз (рис. 18). На фотографии видно, что ДНК закрученная и состоит из двух цепей. Если подобное получится осуществить ученикам на уроке биологии при изучении этой темы – это будет реальная наглядность в строении ДНК.

Рис. 18. ДНК эпителиальных клеток человека. Увеличение в несколько раз.

3.3 Результаты окрашивания полученных молекул ДНК

При добавлении пищевого красителя к уже выделенным молекулам ДНК фактически не произошло окрашивания. Поверхность раздела двух фаз исчезла, жидкости перемешались. Связывания красителя с ДНК не произошло.

При добавлении окрашенного холодного спирта к «раствору» ДНК, наблюдалось образование поверхности раздела фаз, образование молекул ДНК и окрашивание их через некоторый промежуток времени (рис. 19).

Рис. 19. Окрашенные молекулы ДНК.

ВЫВОДЫ

1. Исходя из литературных источников, выяснили, что ДНК это двухцепочечный полимер, который состоит из нуклеотидов четырёх типов.

2. Выделили ДНК из клеток яблока, банана, томата, лука, зелёного горошка и клеток слизистой оболочки ротовой полости человека.

3. Лучшим растительным объектом для получения ДНК является зелёный горошек.

4. Лучшим детергентом для получения ДНК из растительных клеток является моющее средство.

5. Лучшим детергентом для получения ДНК из человеческих клеток является смесь моющего средства с пищеварительным средством «Панкреатин».

6. Окрашивание ДНК происходит при добавлении спирта уже содержащего краситель.

СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ

1. Буферные растворы: приготовление и использование [Электронный ресурс]. – Режим доступа: http://fb.ru/article/44036/bufernyie-rastvoryi-prigotovlenie-i-ispolzovanie

2. Введенский Э. Л., Плешаков А. А. Биология. Введение в биологию. 5 класс. Линия «Вектор». – М.: ООО «Русское слово - учебник», 2012

3. Великов В. А. Молекулярная биология. Практическое руководство. – Саратов: Издательство «Саратовский источник», 2013. – 84 с.2.

4. Лаборатория на кухне (выделение в домашних условиях ДНК) [Электронный ресурс]. – Examen.ru – портал для абитуриентов и их родителей. – Режим доступа:http://www.examen.ru/add/manual/school-subjects/natural-sciences/genetics/stati-2201/laboratoriya-na-kuxne-vyidelenie-v-domashnix-usloviyax-dnk

5. Сивоглазов В. И. Биология: общая биология. 10 кл. Базовый уровень. – М.: Дрофа, 2016. – 254 с.