II Международный конкурс
научно-исследовательских и творческих работ учащихся
«СТАРТ В НАУКЕ»
 
     

ПОЛУЧЕНИЕ ПОЛИСАХАРИДНЫХ ПЛЕНОК ИЗ ДЕКСТРАНОВ
Кривоногов А.В.
Автор работы награжден дипломом победителя первой степени
Диплом школьника      Диплом руководителя
Текст научной работы размещён без изображений и формул.
Полная версия научной работы доступна в формате PDF


 Введение

Актуальность темы. В настоящее время декстраны благодаря широкому спектру своих полезных свойств находит все более широкое применение в самых различных областях, таких как: в промышленности, биотехнологии, химическая технологии и в лабораторной технике. Декстраны широко используются в качестве заменителя плазмы крови, повышения вязкости растворов в молочной и пищевой промышленности, изготовления сефадекса, используемого в биохимической промышленности. Декстрановые гели и их иониты применяют для фракционирования и выделения ферментов, гормонов и других лабильных биологически активных веществ. Соединения с декстраном можно использовать как топливо в ядерных реакторах, катализаторов, керамических покрытий, тугоплавких и ферроэлектрических материалов, а порошки – для приготовления сплавов и пигментов. Пытаются покрывать дешевым неочищенным полисахаридом раздробленный каменный уголь для транспортировки его по трубам или в цистернах. При сгорании такого топлива выделяется минимальное количество вредных веществ. Низко молекулярные формы декстрана с Мr 5-8 kDa можно использовать для разработки пробиотиков или микроэлементозных препаратов, нормализующих у животных обмен веществ, рост и развитие, а также устойчивость к заболеваниям.

Цель работы: изучить биохимическую природу декстранов и получить полисахаридные плёнки из комплекса декстранов с хитозаном.

Объект исследования – химическое строение и свойства декстрана.

Предмет исследования – процесс выделения полисахаридов природного происхождения.

Задачи:

1. Провести анализ научно-популярной и учебной литературы по выбранной теме;

2. Рассмотреть общую характеристику, химическое строение и свойства декстранов;

3. Изучить биологическую роль декстранов;

4. Овладеть методами получения декстрана и хитозана, провести его выделение из бактерии LeuconostocMesenteroides;

5. Получить соединение декстрана с хитозаном – хитозановую пленку.

6. Обобщить результаты исследования и сформулировать выводы по работе.

Методы исследования:теоретические (анализ учебной и научно-популярной литературы по теме исследования, методический анализ, сравнение, теоретическое обобщение); экспериментальный (химический эксперимент); статистические (статистическая обработка результатов).

Теоретическая значимость: изучены общая характеристика, химическое строение, свойства декстранов и их биологическая роль.

Практическая значимость: разработана методика получения декстрана и хитозана из биологических объектов; возможность практического использования данных при изучении биологических и химических дисциплин.

Глава 1. Декстраны – важнейшие полисахариды бактериального происхождения

В данной главе остановимся на рассмотрении вопросов истории изучения, классификации, химическом строении, свойствах и биологической роли декстранов [3],[6],[12],[16].

  1.  
    1. Краткая историческая справка

Декстраны впервые были обнаружены Луи Пастером. Декстран вырабатывается микробами на сахарсодержащих средах и является водорастворимым высокомолекулярным полимером глюкозы. В 1943 г. путем гидролиза нативного декстрана была получена фракция "макродекс", водные растворы которой по свойствам были близки плазме крови. Декстран быстро распространился по всему миру и уже в 1953 г. в СССР был получен раствор декстрана, названный полиглюкином [4].

1.2. Химическое строение и свойства декстранов

ДЕКСТРАНЫ (С6Н10О5)n - группа бактериальных полисахаридов, состоящих из остатков α-D-глюкопиранозы [3]. Молекулы декстранов - разветвленные цепи (см.рис.1), линейная часть которых содержит главным образом 1:6-связи и небольшое количество 1:3-связей (в некоторых редко встречающихся декстранах обнаружены чередующиеся 1:6 и 1:3-связи). Разветвления в молекуле декстрана образуются с помощью 1:2-, 1:3- или 1:4-связей.

Рис.1. Химическая формула декстранов

В индивидуальном плане декстраны обычно имеются один или два типа связей ветвления. Боковые ветви молекулы состоят обычно из одного или двух остатков глюкозы, реже встречаются более длинные боковые цепи. Молекулярная масса декстранов 107-108: [a]D25 индивидуальных декстранов варьирует от + 208 до + 233 ° (формамид) и от + 203 до + 232 ° (1 н. раствор КОН) [13]. Свойства полисахарида зависят от его структуры и молекулярной массы. Известны декстраны, которые хорошо растворимы в воде, формамиде, ДМФА и ДМСО, некоторые растворимы только в растворах щелочи. В ИК спектре декстраны дают полосы поглощения в области 917, 840 и 768 см-1, характерные для 1:6-гликозидных связей. Биосинтез декстранов осуществляется путем расщепления сахарозы с последующим переносом остатка глюкозы на акцептор, которым м. б. сахароза или растущая цепь декстрана [7]. Реакция катализируется ферментом декстрансахаразой. Осуществлен синтез простейшего линейного a-1:6-глюкана полимеризацией 1,6-ангидро-2,3,4-три-О-бензил-a-D-глюкопиранозы в присутствии кислых катализаторов с последующим удалением защитных групп. Декстраны с заданными свойствами м. б. получены с помощью очищенных препаратов декстрансахаразы. Количественное определение декстранов осуществляют по глюкозе, образующейся при его гидролизе. Частично гидролизованные, т. н. клинические, декстраны с молекулярной массой 30-80 тыс. (содержат не менее 95% 1 : 6-связей) используют для приготовления плазмозаменителей противошокового и гемодинамического действия. Декстраны, сшитые поперечными связями эпихлоргидрином (т. н. с е ф а д е к с ы), и их производные - сорбенты в гель хроматографии, ионообменной и гидрофобной хроматографии и электрофорезе[3].

1.3.Биологическая роль декстранов

Со времени разработки технологии получения растворов декстрана и применения их в клинике прошло более 55 лет. В нашей стране первые работы по созданию данного класса препаратов были проведены в Ленинградском НИИ гематологии и переливания крови в 1952 г. Созданный препарат получил название "синкол" [17]. Позже, в 1954 г., сотрудниками Центрального НИИ гематологии и переливания крови был синтезирован хорошо всем известный полиглюкин. Полиглюкин представляет собой 6% раствор декстрана с молекулярной массой 60 000 Д. Благодаря значительной величине молекул углевода он не проникает через мембраны сосудов, поэтому долго удерживается в сосудистом русле (3-4 сут). Лечебное действие объясняется способностью восстанавливать и поддерживать артериальное давление, ОЦК, улучшать сердечную деятельность. Можно вводить внутривенно, внутриартериально, внутрикостно (одновременно до 2000 мл).

Напомним, что декстран является полимером глюкозы и продуцируется бактериями LeuconostocMesenteroidesпри выращивании их на среде, содержащей сахарозу (например, свекольный сок). Относительная молекулярная масса нативного декстрана достигает сотен миллионов дальтон. Нативный декстран подвергается гидролизу до получения препарата с заданным молекулярно-массовым распределением. Именно критерий молекулярно-массового распределения лежит в основе подразделения современных инфузионных сред декстранов на две основные группы [5]:

Iгруппа — низкомолекулярные декстраны, имеющие среднюю молекулярную массу 30 000-40 000 Д;

IIгруппа — среднемолекулярные декстраны, имеющие среднюю молекулярную массу 50 000—70 000 Д.

Современные зарубежные и отечественные препараты декстрана существенно отличаются от тех инфузионных сред, которые применялись в клинической практике в 70-х гг. По сравнению с ними в настоящее время при производстве данных растворов значительно улучшилась их очистка от иммуногенных ингредиентов микробного происхождения, что позволило снизить общее число побочных реакций на декстран ниже уровня реакции на альбумин [4]. Примерно у 60-70% пациентов на фоне парентерального введения полисахаридов сохраняется вероятность образования иммунокомплексов, как следствие реакции «антиген-антитело». Учитывая данное обстоятельство, с целью целенаправленной профилактики декстран индуцированных анафилактоидных анафилактических реакций рядом фирм были разработаны препараты моновалентного гаптен-декстрана, например, моновалентный декстран-1 Fresenius с ММ равной 1000 Д [5].

Методика применения моновалентного декстрана-1 Fresenius: гаптен-декстран вводится перед инфузиями низкомолекулярных и среднемолекулярных декстранов в дозе 20 мл в течение 1-2 мин с целью блокирования антидекстрановых антител. Если декстран-40 или декстран-70 применяется несколько раз в сутки или в течение длительного времени, то достаточно одной предварительной инъекции моновалентного декстрана в приведенной выше дозировке до первой инфузии. Если интервал между двумя инфузиями составляет 48 ч и более, то моновалентный декстран целесообразно вводить перед каждой инфузией [10].

На протяжении десятков лет декстраны отечественного производства существенно уступали по качеству своим зарубежным аналогам, в частности по молекулярно-массовому распределению. Одновременное наличие в растворе (полиглюкин) как высомолекулярных, так и низкомолекулярных фракций декстрана существенным образом влияло на основные физико-химические свойства препарата. Однако на сегодняшний день благодаря усовершенствованию технологического процесса качество отечественных декстранов намного улучшилось.

Молекулы полиглюкина {декстраи-7 0, макродекс ) оказывают положительное влияние на кровообращение в течение 5-7 ч. Декстраны с молекулярной массой 40 000 Д {реополиглюкин, реомакродекс, декстраи-40) обеспечивают большее по выраженности гидродинамическое действие, но в то же время более кратковременное. Увеличение объема плазмы наиболее выражено впервые 90 мин после введения реополиглюкина. Через б ч после инфузии содержание декстрана-40 в крови уменьшается примерно в 2 раза. Основной гемодинамический эффект данного класса кровезаменителей связан с их способностью связывать и удерживать в сосудистом русле воду. Доказано, что 1 г декстрана связывает 20~25 мл воды, в то время как 1 г альбумина способен удерживать только 17 мл. Таким образом, прирост ОЦК при внутривенном введении раствора декстрана-40 может почти в 2 раза превышать объем инфузии [5].

Наряду с нежелательными иммунологическими реакциями на фоне инфузии декстрана возможны и выраженные изменения вязкости крови. Декстран с очень высокой молекулярной массой (более чем 150 000 Д) может привести к агрегации крови. В то же время препараты с молекулярной массой от 40 000 Д и ниже не увеличивают скорость агглютинации.

На сегодняшний день возможны варианты производства декстранов со специальным обогащением Са++, Mg++, K+, лактатом, без хлорида натрия с добавлением 5% и 20% сорбита. Если продукция инфузионных сред декстранов большинства ведущих фармакологических фирм мира хорошо известна, то инфузионные растворы данного класса, выпускаемые отечественными производителями, ассоциируются практическими врачами в основном только с полиглюкином и реополиглюкином. Среди отечественных препаратов нового поколения можно выделить следующие. Полиглюсоль — декстран с молекулярной массой 60 000-80 000 Д, содержащий соли Na+, K+, Са+2, Mg+2. Показания: разные виды шока и коррекция электролитного дисбаланса. Полиоксидин — коллоидный кровезаменитель ге-модинамического действия; создан на основе полиэтиленгликоля-20 000 — синтетического полимера в 0,9% растворе натрия хлорида. Полиоксидин изотоничен и изоонкотичен плазме крови. Это кровезаменитель гемодинамического и реологического действия. Благодаря способности коллоидной основы полиоксидина удерживать жидкость в сосудистом русле, после инфузии препарата возрастает объем циркулирующей крови, а вследствие этого — и сердечный выброс. Препарат уменьшает вязкость крови за счет снижения вязкости плазмы и вызываемой препаратом гемодилюции, оказывает дезагрегирующее действие на форменные элементы крови, восстанавливает периферическое кровообращение, улучшает транспорт кислорода к тканям, за счет чего уменьшается тканевая гипоксия, происходит коррекция кислотно-основного состояния. В течение пяти дней 95% препарата выводится с мочой, около 5% — через желудочно-кишечный тракт. Показания: гиповолемические состояния вследствие шока различной этиологии (травма, острая кровопотеря, ожоги, интоксикация), нарушения периферического кровообращения; массивная кровопотеря. Полиоксидин используют в качестве гемодилюента для заполнения аппаратов искусственного кровообращения. Противопоказания: гипергидратация, гиперволемия, высокое АД, декомпенсированная сердечная недостаточность, черепно-мозговая травма, сопровождающаяся повышением внутричерепного давления. Способ введения и режим дозирования: препарат вводят внутривенно струйно или капельно. При различных видах шока препарат вводят внутривенно струйно взрослым в дозе 400-800 мл на одно введение, детям — 15-20 мл/кг массы тела. При необходимости дозу для взрослых увеличивают до 1200 мл, для детей — до 30 мл/кг массы тела. Скорость введения определяется состоянием больного, величинами венозного и артериального давления, частотой пульса и показателем гематокрита. При нормализации гемодинамических показателей целесообразно перейти на капельное введение препарата. При кровопотере более 500-700 мл и выраженной анемии вливание полиоксидина следует сочетать с переливанием крови. Капельно препарат вводят со скоростью 60-80 капель/мин для взрослых, 30-40 капель/мин — для детей. В случае падения АД переходят на струйное введение препарата. При операциях с использованием аппарата искусственного кровообращения полиоксидин применяют в качестве гемодилюента для заполнения АИК (40-60% перфузионного раствора). Побочное действие: полиоксидин не вызывает аллергических реакций или других побочных эффектов при применении в указанных дозах. При быстром введении препарата или использовании препарата в больших дозах возможно развитие острой перегрузки системы кровообращения. Беременность и лактация: исследования применения полиоксидина при беременности и в период лактации не проводились. Особые указания: после введения полиоксидина необходимо проводить повторное наблюдение за уровнем АД, показателем гематокрита, количеством гемоглобина и эритроцитов, состоянием системы свертывания крови, анализом мочи. Введение полиоксидина не исключает необходимости проведения других противошоковых мероприятий (обезболивание, введение кардиотонических препаратов, тонизирующих и гормональных средств). По мере повышения центрального венозного давления уменьшают дозы и скорость введения полиоксидина. Лекарственное взаимодействие: препарат совместим с кровью, любыми инфузионными средами, средствами противошоковой терапии. Условия и сроки хранения: хранят в сухом месте при температуре от + 10 до +30 °С. Срок годности — 2 года. Допускается хранение препарата в течение не более 2 месяцев при температуре от -40 до + 40°С [4].

Рондеферрин — радиационно-модифицированный декстран с молекулярной массой 60 000±10 000 Д. Вязкостные характеристики препарата находятся на уровне кровезаменителей реологического действия. Препарат стимулирует гемопоэз, поскольку в его состав введено железо в легкоусвояемой форме, а также медь и кобальт, восстанавливает АД, нормализует системную гемодинамику и микроциркуляцию, оказывает иммуностимулирующий и дезинтоксикационный эффект. Рондекс — 6% раствор радиализированного декстрана с молекулярной массой 65 000+5000 Д в 0,9% растворе хлорида натрия. Препарат соответствует международным стандартам для плазмозаменителей типа декстран-70, однако обладает преимуществами в виде сниженной почти в 1,5 раза характеристической и относительной вязкости и уменьшенным размером макромолекул. В то же время препарат обладает дезинтоксикационным свойством, а также эффектом защиты генетического аппарата клеток костного мозга после облучения. Рондекс-М — модифицированный препарат рондекса, насыщенный карбоксильными группами. Препарат дополнительно обладает иммуномодулирующей и пнтерферониндуцирующей активностью. По выраженности гемодинамического действия рондекс-М соответствует полиглюкину, а по влиянию на микроциркуляцию и тканевой кровоток — реополиглюкину. Полифер — является модификацией полиглюкина и состоит из комплекса декстрана с железом. Обладает гемодинамическим действием как полиглюкин, а также способен ускорять эритропоэз при постгеморрагических анемиях. Реоглюман — в его состав входят реополиглюкин, маннитол и бикарбонат натрия. Препарат устраняет тканевый ацидоз, а реологический и диуретический эффекты усилены по сравнению с реополиглюкином.

Реополиглюкин — 10% раствор низкомолекулярного декстрана (молекулярная масса 40 000) в физиологическом растворе. Препарат увеличивает ОЦК, является мощным дезагрегантом эритроцитов (ликвидация стаза), уменьшает вязкость крови, усиливает кровоток. Выражен диуретический эффект. Циркулирует 2-3 суток, но основное количество выводится впервые сутки. Показания: шок травматический, ожоговый, синдром длительного сдавления, профилактика и лечение ТЭ, посттран-сфузионные осложнения, профилактика острой почечной недостаточности. Противопоказания: хронические заболевания почек, геморрагические диатезы. Способ введения и доза: внутривенно в дозе от 500 до 750 мл. Срок хранения — 5 лет при комнатной температуре [4].

Глава 2. Экспериментальное получение плёнок из высокомолекулярных полисахаридов природного происхождения

В этой главе мы подробно остановимся на методике получения декстранов и полисахаридных пленок из хитозана [8],[14].

2.1 Методика получения декстранов

Известен способ получения декстрана путем двухэтапного выращивания культуры Leuconostoc mescuteroides (см. рис. 2,3), инкубации ее при 23 - 25°C с последующим выделением синтезированного декстрана этанолом [1]. Однако известный способ трудоемок и получаемый целевой продукт недостаточно высокого качества [7]. Идентификация разных видов бактерий проводится с помощью различных тестов (см. табл. 1).

Таблица 1

Идентификация видов бактерий рода Leuconostoc

Тест

L.mesente-

roides ss. mesente-

roides

L.mesente-

roides ss. dextra-

nicum

L.mesente-

roides ss. cremoris

L.(W.) para-

mesente- roides

L.pseudo-

mesente-

roides

L.citreum

Рост при температуре:

           

100С

?

?

?

?

+

+

370С

+(-)

+

-

+(-)

+

-(+)

450С

-

?

?

?

-

-

Декстран из сахарозы:

+

+

-

-

?

?

С целью упрощения технологического процесса и улучшения качества целевого продукта, продуцент выращивают на питательной среде, содержащей, %: KCI 0,0095 – 0,01, KH2PO4 0,0095 – 0,01, MgSO4 0,0095 – 0,01, Na2HPO4 *12 H2O 0,45 – 0,50, NH4CI 0,045 – 0,05, соль Мора 0,00095 – 0,001, парааминобензойную кислоту 0,0045 – 0,005, пептон 0,02 – 0,03, глюкозу 1,0 – 1,5, дрожжевой экстракт 0,009 – 0,01, дистиллированную воду до 100 и посевной материал на ферментационной среде, содержащий, %: KCI 0,0095 – 0,01, MgSO4 0,0095 – 0,01, KH2PO4 0,095 – 0,1, Na2HPO4 *12 H2O 0,24 – 0,25, NH4CI 0,045 – 0,05, соль Мора 0,00095 – 0,001, парааминобензойную кислоту 0,0045 – 0,005, пептон 0,1 – 0,3, сахарозу 5,0 – 20,0, первичный декстран 0,1 – 2,0, дрожжевой экстракт 0,35 – 0,50, дистиллированную воду до 100, а целевой продукт обрабатывают раствором перекиси водорода.

Способ осуществляют следующим образом:

К ферментационной среде, содержащей первичный декстран, добавляют живую культуру активного штамма Leuconostoc mescuteroides, выращенную в жидкой среде, содержащей необходимые для развития культуры питательные вещества и не содержащей инициаторов синтеза декстрана. Среду инкубируют при 23 - 25°C, синтезированный декстран выделяют этанолом, растворяют в дистиллированной воде и обрабатывают концентрированным раствором перекиси водорода, с последующим выделением целевого продукта известным методом.

Посевная питательная среда содержит, %: KCI 0,0095 – 0,01, MgSO4 0,0095 – 0,01, KH2PO4 0,095 – 0,1, Na2HPO4 *12 H2O 0,24 – 0,25, NH4CI 0,045 – 0,05, соль Мора 0,00095 – 0,001, парааминобензойную кислоту 0,0045 – 0,005, пептон 0,02 – 0,03, глюкозу 1,0 – 1,5, дрожжевой экстракт 0,009 – 0,01, дистиллированную воду до 100.

Ферментационная среда содержит, %: KCI 0,0095 – 0,01, MgSO4 0,0095 – 0,01, KH2PO4 0,095 – 0,1, Na2HPO4 *12 H2O 0,45 – 0,50, NH4CI 0,045 – 0,05, соль Мора 0,00095 – 0,001, парааминобензойную кислоту 0,0045 – 0,005, пептон 0,1 – 0,3, сахарозу 5,0 – 20,0, дрожжевой экстракт 0,35 – 0,50, первичный декстран 0,1 – 2,0, дистиллированную воду до 100.

Концентрированный раствор перекиси водорода добавляют в количестве 5 – 50 мл на 1 л реакционной смеси.

Способ позволяет получить декстран желаемого молекулярного веса.

Пример 1. Берут 0,5 мл суточной культуры Leuconostoc mescuteroides и вносят 10 мл питательной посевной среды, следующего состава, %: KCI 0,01, MgSO4 0,01, KH2PO4 0,1, Na2HPO4 *12 H2O 0,25, NH4CI 0,05, соль Мора 0,001, парааминобензойную кислоту 0,005, пептон 0,02, глюкозу 2,0, дрожжевой экстракт 0,01, дистиллированную воду до 100.

Через сутки посевную среду в количестве 10% вносят ферментационную.

Состав ферментационной среды, %: KCI 0,01, MgSO4 0,01, KH2PO4 0,1, Na2HPO4 *12 H2O 0,45, NH4CI 0,05, соль Мора 0,001, парааминобензойную кислоту 0,001, пептон 0,1, сахарозу 15, дрожжевой экстракт 0,35, первичный декстран 2,0(молекулярный вес 15,000), дистиллированную воду до 100.

После посева среду хорошо перемешивают и инкубируют при 23 - 25°C. Ферментация считается законченной при падении pH до 4,0 – 4,5.

После окончания синтеза декстрана выделяют этанолом, осадок растворяют в дистиллированной воде, добавляют концентрированный раствор перекиси водорода в количестве 12,5 мл на 1л раствора декстрана.

Раствор выдерживают при комнатной температуре в течение 3 часов, затем добавляют активированный уголь в количестве 3г/л и через 0,5 часа фильтруют.

Дальнейшую обработку декстрана проводят известным методом.

Получают декстран с молекулярным весом 60,000.

Пример 2. Проводят аналогично примеру 1. Первичный декстран добавляют в количестве 1,5% (молекулярный вес 40,000), концентрированный раствор перекиси водорода – 13,4 мл на 1 л раствора декстрана. Получают декстран с молекулярным весом 35,000.

Пример 3. Проводят аналогично примеру 1. Первичный декстран добавляют в количестве 1% (молекулярный вес 58,000). Концентрированный раствор перекиси водорода – 16 мл на 1л раствор декстрана. Получают декстран с молекулярным весом 49,000.

Способ получения декстрана путем двухэтапного выращивания культуры Leuconostoc mescuteroides с последующим выделением целевого продукта этанолом, отличающийся тем, что, с целью упрощения технологического процесса и улучшения качества целевого продукта, продуцент выращивают на ферментационной среде, содержащей, %: KCI 0,0095 – 0,01, MgSO4 0,0095 – 0,01, KH2PO4 0,095 – 0,1, Na2HPO4 *12 H2O 0,45 – 0,50, NH4CI 0,045 – 0,05, соль Мора 0,00095 – 0,001, парааминобензойную кислоту 0,0045 – 0,005, пептон 0,1 – 0,3, сахарозу 5,0 – 20,0, дрожжевой экстракт 0,35 – 0,50, первичный декстран 0,1 – 2,0, дистиллированную воду до 100, к которой добавляют жидкую посевную среду, содержащую, %: KCI 0,0095 – 0,01, MgSO4 0,0095 – 0,01, KH2PO4 0,095 – 0,1, Na2HPO4 *12 H2O 0,24 – 0,25, NH4CI 0,045 – 0,05, соль Мора 0,00095 – 0,001, парааминобензойную кислоту 0,0045 – 0,005, пептон 0,02 – 0,03, глюкозу 1,0 – 1,5, дрожжевой экстракт 0,009 – 0,01, дистиллированную воду до 100, и далее целевой продукт обрабатывают раствором перекиси водорода [7].

Синтетический раствор: 7,5% сахарозы, первичный декстран не добавляют (остальные примеси, как в первом или втором случаях).

Выход равен в среднем 90% теоретических расчетных показателей.

Способ получения клинического декстрана путем микробиологического синтеза, отличающийся тем, что в целях повышения выхода указанного препарата, к среде, содержащей первичный декстран, добавляется живая культура активного штамма Leuconostoc mescuteroides, выращенная на питательной среде, содержащей необходимые для развития культуры органические кислоты и низшие спирты и не содержащей инициаторов синтеза декстрана (особенно сахаров мальтозного и изомальтозного ряда.)

Рис.2. Leuconostoc mesenteroides Рис.3. Leuconostoc mesenteroides

2.2. Методика получения хитина

Используемые биоотходы креветок были предварительно измельчены до размера частиц от 1 до 3 мм, что позволило сохранить баланс между скоростью процесса и снижением потерь тонких частиц при их отделении[9].

Взвешивали несколько проб измельчённого панциря креветок одинаковой массы (см. приложение, рис. 1). Залили 96% раствором C2H5OH для депигментации и оставили на 1,5-2 часа (см. приложение, рис. 2). Депротеинирование проводится с целью удаления из панциря белков и липидов. Для этого панцирь обрабатывается гидроксидом натрия. Вследствие этого процесса получается хитозан, который имеет структурную формулу:

Депротеинирование проводили в 50% растворе NaOH при 180 , варьируя продолжительность процесса (см. приложение, рис. 3,4). По окончании процесса щелочного депротеинирования отделяли супернатант и полностью промывали частицы депротеинированного вещества таким образом, чтобы pH промывных вод стала равным 7 (см. приложение, рис. 5,6).

Деминерализацию креветок проводили с применением 12,5% раствора HCI в течение 2 часов, в результате чего происходит растворение с последующим вымыванием минеральных соединений, содержащихся в панцире (см. приложение, рис.7). По окончании процесса деминерализации оделяли фильтрат и полностью промывали дистиллированной водой до рH=7(см. приложение, рис. 8).

2.3. Методика получения хитозана

Хитозан является аминополисахаридом, полученным при удалении ацетильной группы в хитине в результате обработки его в жестких условиях раствором щелочи, что позволяет заместить ацетильные группы хитина аминогруппами. Таким образом, стадии деацетилирования хитина всегда предшествует процесс его выделения из хитинсодержащего сырья. Хитин как нерастворимый полимер не поддается выделению из панциря напрямую. Для его получения необходимо последовательно отделить белковую и минеральную составляющие панциря, т.е. перевести их в растворимое состояние и удалить. Для получения хитина и его модификаций с воспроизводимыми характеристиками необходимо исчерпывающее удаление белковой и минеральной составляющих панциря. Все известные способы извлечения хитина из ПСС можно разделить на три основные группы: химическая обработка кислотами, щелочами, комплексонами и др.; методы биотехнологии, применение ферментных препаратов и протеолитических бактерий; электрохимический способ [13].

В основе химического способа получения хитозана лежит реакция отщепления от структурной единицы хитина-N-ацетил-D-глюкозамина ацетильной группировки или реакция деацетилирования.

Процесс деацетилирования проводят обычно с помощью концентрированных щелочей при повышенных температурах. Первым опытом получения хитозана, было сплавление хитина с твердой щелочью при 1800С. Этим способом получали продукт со степенью деацетилирования (СД) 95%, но значительно деструктированный (до 20 единиц).

Наиболее распространено деацетилирование растворами щелочей 30-50% -ной концентраций, поскольку оно является более мягким. ДА в водных растворах щелочей может обеспечить 100% -ную степень деацетилирования при использовании ступенчатого процесса и значительно менее деструктурирует хитозан. При получении хитозана в указанных условиях одновременно с реакцией ДА идет деструкция хитина, т.е. разрыв его цепей по гликозидным связям, что приводит к уменьшению молекулярной массы хитозана и снижению его вязкости.

Деацетилирование происходит под действием 50% -ного раствора гидроксида натрия в течение 1 - 2 ч. при температуре 130 – 140оС в атмосфере инертного газа азота, что делает возможным получение хитозана с высокой степенью деацетилирования и молекулярной массой благодаря предотвращению термоокислительной деструкции цепи полимера. Полученный хитозан промывают водой до рН 6,5 и сушат при температуре 60 – 70оС.

Таким образом, предлагаемый способ отличается меньшей стадийностью. Также способ отличается более высокой эффективностью процессов, меньшими трудо - и энергозатратами. Способ позволяет повысить степень деацетилирования до 87-91%, а также предусматривает использование более доступного и дешёвого, в регионах, удалённых от моря.

После ДА и отмывки до нейтрального значения рН хитозан представляет собой сильно гидратированный, набухший продукт с содержанием воды более 70%. Для предотвращения ороговения хитозан сушат при 50-550С. При сушке в условиях более высоких температур хитозан уплотняется, темнеет и теряет растворимость, что снижает возможность его использования.

После выполнения вышеперечисленных операций при разных условиях полученный хитозан растворяли в 4%-ном растворе уксусной кислоты в присутствии глицерина как пластификатора. Образовавшийся вязкий раствор наносили на стеклянную пластинку. Формование пленок из хитозана осуществляли сухим способом [13].

По истечению нескольких суток из хитозана, полученного при различных условиях, образовывались пленки высокомолекулярных соединений.

В ходе проведенного экспериментального исследования можно сделать следующие выводы:

  1. Хитозан можно получить из хитина членистоногих;

  2. Доступным сырьем для получения хитина являются панцири креветок;

  3. Необходимыми условиями для получения хитозана являются процессы депротеирования, деацетилирования и деминерализация.

  4. Формование пленок зависит от качества полученного хитозана, т.е. степени его деацетилирования и отсутствия минеральных и белковых компонентов.

Заключение

В ходе проделанной работы были сделаны следующие выводы:

1. Проведенный анализ учебной и научно-популярной литературы по данной теме показал, что декстраны широко распространены в бактериальном мире, имеют очень разветвленное строение, в основе которого лежит α- глюкоза.

2. Декстраны обладают комплексом уникальных физико-химических свойств, из которых наиболее активно используются в различных областях промышленности их пленко- и волокнообразующие, адсорбционные характеристики и способность к биодеструкции.

3. Экспериментальным путем декстраны были выделены из бактерии Leuconostoc Mesenteroides, которая была выращена на питательной среде.

4. Была разработана методика получения соединения декстрана с хитозаном – хитозановая пленка, которая позволяет получить продукт, обладающий высокой степенью деацетилирования, низким содержанием минеральных и белковых компонентов и проявляющий хорошие пленкообразующие свойства.

5. Установлено, что при химическом способе получения хитозана наиболее оптимальными условиями являются следующие: депротеинирование в 60%-ном растворе NaOH, деминерализация в 15%-ном растворе НСl и деацетилирование в 60%-ном растворе NaOH.

Список литературы:

1.Аникиев В.В., Лукомская К.А. Руководство к практическим занятиям по микробиологии. - М.: Просвещение, 1983.

2.Ленинджер А. Основы биохимии. - М.: Мир, 1985.- Т.1-3.

3.Неотложная медицинская помощь / под ред. Дж.Э. Тинтиналли, Р. Кроума. Пер. с англ. д-ра мед. наук В.И. Кандрора. – Москва: Медицина, 2001.

4. Переливание крови и кровезаменителей в хирургии и педиатрии: Учебное пособие. - М.: Издательско-торговая корпорация «Дашков и К°», 2006. - 128 с. 5.Поздеев О. К. Медицинская микробиология/ под ред. В. И. Покровского. – М.: Гэотар-мед, 2001. – 778 с.

6.Преображенская М.Е., Декстраны и декстраназы // Успехи биологической химии - Т. 16 - М.,1975. - С. 214-35;

7.Преображенского Н.А., Евстигнеевой Р.П. – М.: Химия, 1970. – 320 с.

8.Современные перспективы в исследовании хитина и хитозана: Материалы Девятой Международной конференции. – М.: Изд – во ВНИРО, 2008. – 494с.

9.Страйер Л. Биохимия. - М.: Мир, 1984. – Т.1-3.

10.Филлипович Ю.Б. Основы биохимии. - М.: Высшая школа, 1985.- 450 с.

11. Химия биологически активных природных соединений / Под ред.

12.Dextran bibliography, ed. by A. Jeanes, Wash., 1978; WalkerG.J., "Internet Rev. of Biochem.", Biochemistry of Carbohydrate, v. 16, Balt., 1978, p. 75-126.

M.E. Преображенская.

13.The Gram-positive cocci: part II: Streptococci, Enterococci, and the "streptococcus-like" bacteria. In: Koneman E.W., Alien S.D., Janda W.M., Schreckenberger P.C., Winn W.C., editors. Color Atlas and textbook of diagnostic microbiology. Philadelphia: Lippincott; 1997. p. 577-

14.Elibrary.ru

15.«Википедия» http://ru.wikipedia.org/

Приложение

Рис. 1. Пробы измельчённого панциря креветок

Рис. 2 Заливание пробы 96% раствором C2H5OH для депигментации

Рис.3 Депротеинирование 50% раствором NaOH

Рис.4 Подготовка к депротеинированию

Рис.5 Промывание частиц депротеинированного вещества

Рис.6 Измерение pH промывных вод

Рис.7 Деминерализация креветок с применением 12,5% раствора HCI

Рис. 8 Промывание дистиллированной водой до рH=7

26