II Международный конкурс
научно-исследовательских и творческих работ учащихся
«СТАРТ В НАУКЕ»
 
     

КАЧЕСТВЕННЫЙ АНАЛИЗ МНОГОКОМПОНЕНТНЫХ ЛЕКАРСТВЕННЫХ ПРЕПАРАТОВ МЕТОДАМИ ТСХ И ИК-ФУРЬЕ СПЕКТРОМЕТРИИ
Нарыкина А.И.
Автор работы награжден дипломом победителя первой степени
Диплом школьника      Диплом руководителя
Текст научной работы размещён без изображений и формул.
Полная версия научной работы доступна в формате PDF


1. ВВЕДЕНИЕ

В настоящее время чрезвычайно актуальным является контроль качества фармацевтических препаратов (как сырья, так и готовой продукции) и надежное выявление фальсификатов.

При входном контроле качества сырья требуется определить подлинность субстанции и вспомогательных веществ, использующиеся в производстве лекарственных препаратов.

В фальсифицированных лекарственных препаратах действующие вещества могут быть заменены на более дешевые и менее эффективные, а могут и вовсе отсутствовать. Такие препараты не обладают нужными свойствами и для их выявления требуются экспрессные и точные методы.

В криминалистической практике чаще необходимо анализировать лекарственные препараты неизвестного состава, для этого используются методы, не требующие стандартов, простые и быстрые в выполнении.

Во всех фармакопейных статьях РФ метод ИК спектрометрии рекомендуется для определения подлинности субстанций и готовых лекарственных форм. Однако, при анализе многокомпонентных препаратов спектры компонентов могут накладываться и тем самых искажать суммарный спектр, что не позволяет с использованием исключительно ИК спектрометрии определить, какие компоненты входят в состав препарата. Необходимо провести предварительное разделение всех действующих компонентов этих лекарственных препаратов с помощью ТСХ, а лишь затем провести их идентификацию с использованием ИК-Фурье спектрометрии.

Целью данной работы являлась разработка общего подхода к идентификации компонентов сложных лекарственных препаратов на примере пенталгинов с использованием сочетания методов тонкослойной хроматографии и ИК-Фурье спектрометрии.

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

  1.  
    1. Исследуемые соединения

Ненаркотические анальгетики и нестероидные противово­спали­тельные средства часто назначают для лечения болей различного происхождения слабой и средней интенсивности (головная боль, мышечная боль, в том числе при простудных заболеваниях, гриппе и других острых респираторных заболеваниях, зубная боль и т.д.), как жаропонижающие при лихорадочных состояниях, сопровождающих многие заболевания, чаще инфекционные. По уровню потребления они относятся к наиболее популярным лекарствам во всем мире. Это связано еще и с тем, что многие из них входят в списки безрецептурного отпуска, и, значит, легко доступны для населения.

Поскольку воспалительные процессы, в зависимости от локализации, могут сопровождаться спазмами мускулатуры, сильными болями, кашлем, насморком, отеками и другими нарушениями функций организма. Ненаркотические анальгетики и нестероидные противовоспалительные средства сочетают с другими компонентами (спазмолитики, наркотические анальгетики, отхаркивающие средства, витамины, кофеин, средства, улучшающие микроциркуляцию), которые могут оказывать взаимо­дополняющее действие или усиливать (потенцировать) эффекты друг друга.

Пенталгины – комбинированные препараты, оказывающие аналь­гези­рующее, противовоспалительное, спазмолитическое, жаропонижающее действие. В состав пенталгинов, в зависимости от марки, могут входить такие лекарственные субстанции, как парацетамол, метамизол натрия, напроксен, дротаверин а также различные наполнители: кофеин, фенирамин, кодеин, фенобарбитал, магния стеарат, крахмал.

Названия и некоторые свойства основных лекарственных субстанций, входящих в состав пенталгинов представлены в табл. 1.

Таблица 1

Свойства основных компонентов «пенталгина»

Название компонента и его свойства

Химическая формула

Анальгин [(1,5-диметил-3-оксо-2-фенил-2,3-дигидро-1Н-пиразол-4-ил)(метил)амино]-метансульфонат натрия, моногидрат. Белые кристаллы без запаха. Растворим в воде, умеренно в спирте 96 %, не растворим в хлороформе.

 

Дротаверина гидрохлорид (но-шпа) 1-(3,4-диэтоксибензил)-6,7-диэтокси-3,4-дигидроизохинолина гидрохлорид. От светло-желтого до зеленовато-желтого цвета кристаллы без запаха. Растворим в хлороформе, в спирте, умеренно – в воде.

 

Напроксен (налгезин) (S)-2-(6-метокси-2-нафтил)проионовая кислота. Белый кристаллический порошок. Практически нерастворим в воде, растворим в спирте 96% и метаноле, мало растворим в эфире.

 

Парацетамол N-(4-гидроксифенил)ацетамид. Белые кристаллы. Растворим в спирте, ацетоне и растворах едких щелочей, умеренно – в воде.

 

Парацетамол – ненаркотический анальгетик; блокирует цикло­оксигеназу преимущественно в центральной нервной системе, воздействуя на центры боли и терморегуляции; оказывает анальгетическое и жаро­понижающее действие.

Метамизол натрия – нестероидное противовоспалительное средство, обладающее выраженным анальгетическим эффектом.

Напроксен – нестероидное противовоспалительное средство, оказывает противовоспалительное, анальгезирующее и жаропонижающее действие, связанное с неселективным подавлением активности циклооксигеназы, регулирующей синтез простагландинов.

Кофеин – психостимулирующее средство, вызывает расширение кровеносных сосудов скелетных мышц, сердца, почек; повышает умственную и физическую работоспособность, способствует устранению утомления и сонливости; увеличивает проницаемость гистогематических барьеров и повышает биодоступность ненаркотических анальгетиков, способствуя тем самым усилению терапевтического эффекта. Оказывает тонизирующее действие на сосуды головного мозга.

Дротаверин – оказывает миотропное спазмолитическое действие, обусловленное ингибированием ФДЭ 4, действует на гладкие мышцы ЖКТ, желчевыводящих путей, мочеполовой системы, сосудов.

Фенирамин – блокатор гистаминовых H1-рецепторов. Оказывает спазмолитическое и легкое седативное действие, уменьшает явления экссудации, а также усиливает анальгезирующее действие парацетамола и напроксена.

Кодеин оказывает центральное противокашлевое действие (за счет подавления возбудимости кашлевого центра), а также обезболивающее действие, обусловленное возбуждением опиатных рецепторов в различных отделах ЦНС и периферических тканях, приводящим к стимуляции антиноцецептивной системы и изменению эмоционального восприятия боли.

Фенобарбитал повышает анальгезирующее действие метамизола натрия и напроксена.[1]

2.2. Методы анализа лекарственных препаратов

Для контроля качества серийно выпускаемых многокомпонентных лекарственных препаратов «Пенталгин» разработан ряд валидных методик. Данные методики инструментального анализа направлены на разделение и количественное определение действующих веществ. Используют метод хроматографии в тонких слоях сорбента (ТСХ).

Хроматографическое разделение проводят на пластинках Sorbfil 100×100: СТХ-1A, 5 – 15 мкм, 100 мкм, ПЭТФ (г.Краснодар) и Silica gel 60 F254 50 HPTLC plates 20×10 cm (Merck). На пластинку наносят растворенные в смеси ацетонитрила и этилового спирта многокомпонентный препарат, компоненты, входящие в него (свидетели) и искусственную смесь. Для обнаружения лекарственных веществ на хроматограммах применяют обработку окрашивающим реактивом (смесью растворов 0,1 н. йода и 0,1 н. хлористоводородной кислоты в соотношении 7:3), параллельно используют УФ детектирование при длине волны 254 нм. [2]

Содержание действующих веществ в составе многокомпонентных лекарственных препаратов неодинаково и обусловлено их фармакологическими свойствами. Этот фактор важен при анализе таких препаратов методом ВЭЖХ. При большом различии содержаний компонентов и соответственно величинах пиков на хроматограмме наблюдается превышение диапазона линейности детектирования и возрастание отрицательного влияния шумов базовой линии и посторонних пиков. Поэтому некоторые исследователи предлагают раздельно определять компоненты препарата, содержащиеся в разных количествах. [3]

Но многокомпонентные препараты можно анализировать и в одну стадию, получая более высокую точность результатов. Например, при анализе таблеток «Пенталгин ICN» (содержание парацетамола и анальгина в таблетке превышает содержание фосфата кодеина в 37.5 раз) методом градиентной ВЭЖХ средняя относительная погрешность определения фосфата кодеина не превышала 2.0 %. [4]

Для количественного определения действующих компонентов в медицинском препарате «Пенталгин» также применяют метод высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ). В качестве стандартов определяемых веществ использовали фармацевтические субстанции. Хроматографический анализ проводили на хроматорафе “Waters Alliance 2695” с диодно-матричным детектором “Waters 2996”, колонки заполняли обращено-фазовым сорбентом “Zorbax SB C8”. В качестве подвижной фазы применяли ацетонитрил. [5]

Метод ВЭЖХ был также применен для идентификации и определения количества фармацевтических препаратов, содержащих парацетамол и/или ацетилсалициловую кислоту, в смеси с антигистаминами (фенилэфрин, малеат фениламина, дифенилгидрамин) и другими добавками такими, как сульфат хинина, кофеин или фосфат кодеина. В предложенном методе разделяют компоненты на колонке Waters Acquity BEH C18 (2 мм×100 мм, 1.7 м) с градиентным элюированием, используя водный ацетат – аммонийный буфер с pH= 4.0 и метанол, как органический модификатор.[6]

3. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

3.1. Исследуемые соединения

Характеристики анализируемых лекарственных препаратов представлены в табл. 2.

Таблица 2

Исследуемые лекарственные препараты

Название

Производитель

Состав таблетки

1

Пенталгин ICN

ОАО «Фармстандарт-Лексредства», Россия

Метамезол натрия 300 мг, парацетамол 300 мг, кофеин 50 мг, Кодеина фосфат 8 мг, Фенобарбитал 10 мг

2

Пенталгин

ОАО «Фармстандарт-Лексредства», Россия

Амидопирин 300 мг, Анальгин 300 мг, кофеин бензоната-натрия 50 мг, кодеин 10 мг, фенобарбитал, 10 мг

3

Цитрамон П

ОАО «Уралбиофарм», г. Екатеринбург

Кислоты ацетилсалициловой кислоты 240 мг; Парацетомол 180 мг; кофеин 30 мг

4

Анальгин

ОАО «Фармстандарт»

Метамезол натрия 500 мг

5

Баралгин

ОАО «Aventis»

Метамизол Натрия 500 мг

6

Налгезин

КРКА, Словения

Напроксен 275 мг

7

Ацетилсалициловая кислота

ОАО «Дальхимфарм» г.Хабаровск

Ацетилсалициловая кислота 500 мг;

8

Парацетамол

«Фармстандарт-Лексредства» Россия г.Курск

Парацетамол 500мг

3.2. Методики исследования

ИК-спектры исследуемых лекарственных препаратов записывали на ИК-Фурье спектрометре SPECTRUM 100 (PerkinElmer, США) с на приставкой нарушенного полного внутреннего отражения (НПВО) фирмы Pike Technologies Inc. в интервале волновых чисел 550-4000 см–1.

Перед разделением компонентов лекарственных препаратов методом ТСХ проводили экстракцию их из таблеток с помощью дистиллированной воды. Для этого 1 таблетку лекарственного препарата перетирали в агатовой ступке, добавляли к полученному порошку 3 мл воды, перемешивали и через 10 минут центрифугировали. Полученный центрифугат упаривали до 0,5 мл и использовали для нанесения на стартовую линию ТСХ пластин. Хроматографическое разделение проводили на пластинах для ТСХ ПТСХ-П-А-УФ (Sorbfil, Россия). В качестве подвижных фаз использовали органические растворители и их смеси. Использовали вариант восходящей тонкослойной хроматографией с предварительным насыщением хроматографической камеры парами подвижной фазы. Пробы анализируемых лекарственных соединений наносили с помощью капилляра в количестве 5-10 мкмл. Проявляли хроматограммы в ультрафиолетовом свете при длинах волн 254 и 356 нм.

Зоны компонентов после их разделения вырезали с ТСХ пластин. Сорбент с этих зон переносили в стеклянные колонки и промывали 10 мл ацетона. Экстракты объединяли, выпаривали, и записывали ИК спектры полученных остатков.

4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Анализ многокомпонентных смесей является важной задачей в практической химии, решение которой во многом требует использования современного дорогого оборудования, доступного не всем аналитическим лабораториям.

Нами в качестве альтернативного метода предложен алгоритм идентификации компонентов сложных смесей с использованием сочетания методов ИК-Фурье спектрометрии и ТСХ.

Анализ включает следующие стадии:

1. Запись ИК спектра исходного образца

2. Подбор растворителя (экстрагента) с одновременной записью спектров как осадка, так и раствора.

3. Подбор оптимальных условий для разделения компонентов с использованием ТСХ.

4. Извлечение зон компонентов с ТСХ пластины и идентификация их по библиотекам ИК спектров.

ИК спектр образца позволяет сделать предположения о наличии различных классов соединений по групповым частотам. Этот спектр также широко используется на втором этапе анализа.

При подборе экстрагента необходимо использовать ряд растворителей, начиная с неполярных (гексан, гептан) и заканчивая сильнополярными (вода, спирты и др.), с целью максимального извлечения компонентов. Для осадков и экстрактов, упаренных досуха на воздухе или в вакууме, также необходимо записать ИК спектры и сравнивать их со спектром исходного компонента.

Данная процедура позволяет по интенсивности и количеству частот в спектрах выбрать наиболее подходящий растворитель (или несколько экстрагентов), а зачастую и идентифицировать некоторые компоненты пробы, например, полимерные составляющие.

Для метода ТСХ наиболее важной задачей является подбор оптимальной подвижной фазы, которая позволит наиболее полно разделить компоненты. Так как априорно предполагается, что о природе аналитов нет достоверных сведений, то подбор оптимальной хроматографической системы целесообразно проводить, начиная с неполярных и заканчивая полярными однокомпонентными подвижными фазами. Двух и трехкомпонентные фазы подбираются на основании количества зон компонентов, обнаруженных на хроматограмме и значений их Rf.

На заключительной стадии анализа зоны компонентов экстрагируют с ТСХ пластины для исключения мешающего воздействия сорбента и записывают их ИК спектры. При наличии соответствующих библиотек идентификация компонентов проводится с достаточно высокой надежностью.

Для достижения поставленной цели нами были изучены ИК спектры исходных лекарственных препаратов (рис. 1), из которых видно, что спектры «Пенталгина» и «Пенталгина ICN» практически совпадают со спектром «Панадола». Это объясняется тем, что именно парацетамол является основным действующим веществом этих образцов, и его спектр перекрывает сигналы от других компонентов, таких как напроксен и дротаверин. Вместе с тем уширение спектра «Пенталгина ICN» в области 1100-1300 см –1 связано с влиянием анальгина, присутствующего в данном препарате в такой же концентрации, что и парацетамол.

Сложный характер спектров «Пенталгина» и «Пенталгина ICN» не позволяет только с использованием ИК-Фурье спектрометрии определить, какие компоненты в них входят. Именно поэтому нами было предложено провести предварительное разделение всех действующих компонентов этих лекарственных препаратов с помощью ТСХ, а затем провести их идентификацию с использованием ИК спектров.

Рис. 1. ИК-спектры исследуемых соединений: пенталгин (А), пенталгин ICN (B), анальгин (C), парацетамола (D), налгезин (E)

Разделение компонентов лекарственных препаратов проводили с использованием пластин для ТСХ с силикагелем и подвижных фаз, состоящих из воды, органических растворителей и их смесей. При использовании в качестве подвижной фазы н-гексана, Rf всех компонентов оказался равен 0. В хлороформе, толуоле и бензоле не удалось разделить пенталгины на отдельные компоненты. Наилучшие результаты разделения компонентов смесей было достигнуто в таких подвижных фазах, как вода, ацетон, этанол. Значения Rf для компонентов лекарственных препаратов представлены в табл. 3.

Как следует из данных, приведенных в табл. 3, не все компоненты пенталгинов были зафиксированы на хроматограммах. Это может быть следствием как неполного извлечения препаратов водой, так и следствием их низкого содержания в препарате. Вместе с тем, из данных ТСХ видно, что, используя в качестве подвижной фазы ацетон, можно однозначно идентифицировать парацетамол (Rf=0,89), содержащийся в препаратах Пенталгин ICN и Цитрамон П, а также метамезол натрия (Rf=0,65) и ацетилсалициловую кислоту (Rf=0,66).

Таблица 3

Rf компонентов исследуемых лекарственных препаратов

Лек. Препарат

Подвижная фаза

Вода

Ацетон

Этанол

Пенталгин ICN

0,66

0

0,65

0,87

0,68

Пенталгин

0,55

0,73

0,09

0,48

0,69

0,84

0,54

0,75

Цитрамон П

0,82

0,66

0,87

0,86

Анальгин

0,69

0,64

0,72

Баралгин

0,63

0,67

0,76

0,61

0,80

0,83

Налгезин

0

0,42

0,68

Ацетилсалициловая кислота

0,52

0,66

0,32

Парацетамол

0,29

0,73

0,89

0,65

Так как при идентификации компонентов сложных смесей опираться только на совпадение значений Rf нельзя, нами были получены ИК спектры всех зон, полученных при разделении «Пенталгинов» с использованием ацетона в качестве подвижной фазы.

Сравнение спектров экстракта хроматографической зоны с Rf равным 0,89 с библиотечными спектрами (рис. 2) подтвердило, что этой зоне соответствует парацетамол.

Идентификация компонентов «Пенталгина ICN», которые на хроматограмме в ацетоне дают хроматографические зоны с Rf =0,65 и 0,87, позволила определить в них метамезол натрия и парацетамол. Для «Пенталгина» Rf =0,69 и 0,84 соответствуют метамезолу натрия и амидопирину. Для «Цитрамона П» Rf =0,66 и 0,87 соответствуют ацетилсалициловой кислоте и парацетамолу.

Рис. 2. ИК спектры хроматографической зоны с Rf =0,89 (подвижная фаза – ацетон) (А) и библиотечный спектр парацетамола (В)

Остальные компоненты лекарственных препаратов нами не были зафиксированы из-за их низкого содержания в таблетках.

Таким образом, можно утверждать, что идентификация компонентов лекарственных препаратов с использованием сочетания методов ТСХ и ИК-Фурье спектрометрии дает надежные результаты и может быть применима даже для таких компонентов, стандарты которых являются очень дорогими или практически недоступными.

5. ВЫВОДЫ

1. Исследованы возможности применения сочетания тонкослойной хроматографии – ИК-Фурье спектрометрии в качественном анализе лекарственных препаратов. Определены значения Rf компонентов препаратов Пенталгина, Пенталгина ICN, Цитрамона П, Анальгина, Баралгина, Налгезина, Ацетилсалициловой кислоты и Парацетамола.

2. Показано, что, используя лишь ИК спектры, невозможно идентифицировать компоненты, входящие в состав «Пенталгинов», так как сигналы панадола перекрывают линии поглощения других компонентов. Использование сочетания методов ТСХ и ИК-Фурье спектрометрии позволяет провести разделение смеси лекарственных препаратов и идентифицировать отдельные компоненты по их ИК спектрам.

6. СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ

1. Инструкция по медицинскому применению препарата «Пенталгин». ООО «Фармстандарт-Лексредства».

2. Паньжин В.С., Будко Е.В., Голубицкий Г.Б. Применение ТСХ для контроля качества многокомпонентных препаратов «Пенталгин ФС» и «Пенталгин Н» // Ж. Заводская лаборатория. Диагностика материалов – 2009. – №8. – С. 25-27.

3. Вергейчик Е.Н., Онегова Н.С. / Фармацея – 2001. – Т.50. – С.24.

4. Голубицкий Г.Б., Басова Е.М., Иванов В.М. Влияние нагрузки на колонку на правильность результатов анализа таблеток «Пенталгин Н» методом градиентной высокоэффективной жидкостной хроматографии //Ж. аналитической химии – 2008. – Т.63 – №3. – С.279-283.

5. Голубицкий Г.Б., Иванов В.М. Количественный анализ некоторых лекарственных препаратов методом высокоэффективной жидкостной хроматографии // Ж. Вестник Московского университета сер.2.химия. – 2009. – Т.50 – №4. – С. 261-266.

6. Deconinck E., Sacre P.Y., Baudewyns S., Courselle P., De Beer J. A fast ultra high pressure liquid chromatographic method for qualification and quantification of pharmaceutical combination preparations containing paracetamol, acetyl alicylic acid and/or antihistaminics // J. of Pharmaceutical and Biomedical Analysis – 2011. – V. 56 – P. 200-209.