II Международный конкурс
научно-исследовательских и творческих работ учащихся
«СТАРТ В НАУКЕ»
 
     

ПРИМЕНЕНИЕ ОРГАНИЧЕСКИХ СОЕДИНЕНИЙ СЕЛЕНА В КОМБУСТИОЛОГИИ
Богданова А.В.
Текст научной работы размещён без изображений и формул.
Полная версия научной работы доступна в формате PDF


Введение

В последнее время интенсивно изучается роль селена в биохимических процессах, протекающих в живых организмах, поскольку он является необходимым ультрамикроэлементом, входящим в состав ферментов, участвующих в окислительно-восстановительных реакциях [1-3]. В настоящее время многие хронические заболевания человека, такие как рак, атеросклероз, сердечно-сосудистые, артрит и др., связывают с недостаточностью селена [4-8]. Известно, что селен, входящий в состав глутатионпероксидазы, оказывает защитное действие от окислительного воздействия свободных радикалов, катализируя распад перекиси водорода или разложение гидроперекисей липидов, т.е. выполняет функции антиоксиданта [9,10].

Обнаружено [11], что неорганические соединения селена, используемые в качестве пищевых добавок, обладают политропным действием и способны поражать такие органы, как печень, почки, а также органы центральной нервной системы.

Соединения селена влияют на заживление органов и гомогенатов органов. Установлено, что накопление селена в мембранах субклеточных органелл определяется, прежде всего, высоким уровнем содержания витамина Е. Доказана вовлеченность селена в процесс фоторецепции. Селен определяет нормальное течение эмбриогенеза.

Для селена выявлено ДНК-тропное действие. Так, при внесении в реакционную среду различных соединений селена происходит ингибирование синтеза РНК. Было установлено, что рак чаще диагностировали у людей с низкими концентрациями селена в крови. Вероятно, при снижении концентрации селена в крови активируется процесс транскрипции и связанный с ним процесс злокачественного роста. Селен оказывает защитное действие против некоторых видов рака у экспериментальных животных.

Селен защищает против токсичности некоторых ксенобиотиков, например параквата, оказывающим свое токсическое действие через усиление переокисления липидов. Дефицит селена усугублял повреждение легких у крыс, вызываемое паракватом, и приводил к повреждению печени, которое не наблюдалось у контрольных животных, подвергавшихся воздействию этого соединения.

Селен оказывает защитное действие при острых и хронических отравлениях ртутью. Было показано, что удовлетворительные с позиций питания концентрации селена в рационе снижают хроническую токсичность метилртути.

  1. ОСНОВНАЯ ЧАСТЬ

    1. Роль селена в биохимических процессах

В возникновении многих патологических процессов значительную роль играет свободно-радикальное окисление липидов биологических мембран, которое приводит к нарушению клеточного метаболизма. Своевременное ингибирование свободно-радикального окисления липидов может способство-вать предотвращению развития патологических процессов. Наиболее значимая биологическая функция селена в организме человека, животных и птиц состоит в обеспечении эффективной работы защитной антиоксидантной системы организма. Cелен участвует в функционировании глутатионпероксидазы и каталазы, предохраняя клеточные мембраны от окислительной деструкции [12].

Обнаружено [13,14], что 4Н-cеленопираны обладают высокой анти-микробной ак­­тив­­ностью в от­ношении стафилококков и грибов рода Кандида. LD50, оп­ре­де­­ленная при од­но­крат­ном внутрибрюшинном введении белым мышам, бы­ла более 700мг/кг. На клинических штаммах, выделенных от гнойносеп­ти­чес­­ких боль­ных в хирургических клиниках, которые были устойчивы к пенициллину, стреп­томицину, левометицину, ампицил­лину, мономицину, а штаммы Кандида к нистатину, леворину, амфотерицину МБСК для ука­зан­ных объек­тов нахо­дит­ся в пределах 0,78-6 мкг/мл [13,14]. Высокую противоста­фило­кок­ковую и антигриб­ко­вую активность проявляют соли селенопирилия, которые также могут подавлять репродукцию фагов и зна­чи­тельно превос­хо­дят та­кие противоопухолевые ан­ти­био­­тики, как рубомицин и блеомицин [15,16].

В последние годы найдена взаимосвязь в орга­низмах человека и животных между селеном и другими микроэле­мен­тами такими как: цинк, иод, медь и др.[17, 18].

Изучение различных аспектов биологического действия селенорга-нических соединений позволит выяснить вероятный механизм антибакте-риального, а также антиоксидантного действия изучаемых соединений и на основе полученной информации синтезировать новые более эффективные малотоксичные препараты селена. Структура халькогенсодержащих арил-алифатических 1,5 - дикетонов позволяет рассматривать их как потен-циальные антиоксиданты, взаимодействующие как с гидроперекисями, так и, при условии монооксигеназной модификации, с органическими радика-лами:

1,5-дифенил-3-селенапентандион-1,5 (ДАФС – 25)

Введение некоторых селенсодержащих соединений (селенит и селенат натрия) в организм снижает токсическое действие ряда тяжелых металлов, однако эти соединения обладают высокой токсичностью [19,20].

Цель данного исследования – изучить возможность применения селенсодержащих 1,5- дикетонов при лечении ожогов на подопытных животных.

  1.  
    1. Экспериментальная часть

Объектами исследования, используемыми в работе, являлись:

ДАФС-25 диацетофенонилселенид 1

Хлорид 2,4,6- трипараметоксифенилселенопирилия 2,

9-парахлорфенил-симм.-октагидроселеноксантен 3,

9-парафторфенил-симм.-октагидроселеноксантен 4,

9-фенил-1 -оксопергидроселеноксантен 5.

1,5-дифенил-3,3-дихлор-3-селенапентандиона-1,5 6

  1.  
    1.  
      1. Методика лечения подопытных животных селенсодержащими соединениями

При работе с животными использовали фиксирующее устройство (Рис. 1). Растворы препаратов с помощью зонда вводили в пищевод. Объемы растворов (10 мкл) дозировали с помощью микродозатора («Gilson», Франция).

Учитывая растворимость препаратов в гидрофобных веществах (оливковое масло), их вводили подопытным животным растворенными в соответствующем объеме масла (16 мкг препарата на 10 мкл масла) при помощи «Ленпипета».

Для проведения процедуры перорального введения вещества в организм подо-пытных животных, их кормления, животных помещали в фиксирующее устройство. При проведении эксперимента животные содержались в специальных клетках и получали, в соответствии с диетой, дневной рацион пищи.

Для проведения опытов по принципу аналогов из беспородных белых мышей-самцов были сформированы четыре опытные и одна контрольная группа животных по 5 особей в каждой.

Животным первой группы после ожога наносилась повязка с мазью Левомеколь.

Животным второй группы после ожога перорально вводили препарат ДАФС-25 из расчета 0,8 мг/кг.

Животным третьей группы после ожога наносилась повязка с препаратом ДАФС-25.

Животным четвертой группы после ожога перорально вводили 1,5-ди-(п-хлорфенил)-З-селенапентандион-1 ,5 из расчета 0,8 мг/кг.

Животным пятой группы после ожога наносилась повязка с 1,5-ди-(п-хлорфенил)-3-селенапентандионом-1,5 из расчета 0,8 мг/кг.

Перед проведением эксперимента животное необходимо было ввести в наркоз, для этого внутримышечно вводили смесь калипсола и дропередола (из расчёта соответственно калипсола - 70 мг/ кг массы тепа животного, дропередола -1 мг/кг).

После введения в наркоз на спине у животного ножницами срезали шерсть, а остатки волос выбривали, чтобы выбритая поверхность была в 2 раза больше, чем диаметр горлышка пробирки.

Рис. 1. Схема фиксирующего устройства.

  1.  
    1.  
      1. Методика нанесения ожогов

Затем кипяток наливали в чистую тёплую пробирку до половины, плотно при-жав животное к горлышку, пробирку переворачивали дном вверх, чтобы кипяток соприкасался с кожей животного, и удерживали её в таком положении 15 секунд (предполагается получение модели ожога III A степени).

Вздувшийся на образовавшейся ране пузырь или отслоившуюся кожу срезали ножницами. С четырёх сторон от раны кожу животного прошивали шелковыми нитками, швами на расстоянии 3-5 мм от краёв раны, и образовавшиеся нитки связали попарно над марлей, туго прижав её к поверхности раны.

Смену повязок осуществляли первый раз через 2 дня, затем 3 раза в неделю.

Наблюдения проводили с помощью микроскопа и снимки делали с помощью цифрового фотоаппарата с выводом результатов на монитор компьютера.

  1.  
    1.  
      1. Методика исследования цитотоксической активности селеноорганических соединений

В экспериментах исследовались штаммы Е.соli НВ-101, С-600, К-12. Единичная колония выращивалась в 1,5 мл LВ-среды (10 г бактотриптона фирмы "Рronadisa", 5 г дрожжевого экстракта фирмы "Рronadisa", 10 г NаС1, 50 мг NаОН фирмы "Sigma", рН 7,5 и до 1 л дистиллированной водой) в пронумерованных пробирках объемом 2 мл фирмы "Ерреndorf" при 37 °С в течение 12 ч до оптической плотности 0,2 - 0,4 о.е. (λ = 600 нм).

Оптическая плотность соответствовала логарифмической фазе роста клеток и измерялась на спектрофотометре Sресоrd М40. Твердая питательная среда готовилась из питательного агара в пропорции 5,5 г порошка на 100 мл дистиллированной воды, автоклавировалась в течение 60 минут при 1 атм, разливалась на чашки Петри диаметром 60 мм (10 мл), чашки стерилизовались ультрафиолетовым излучением в течение 30 минут. В экспериментах использовались только свежеприготовленные твердые питательные среды.

Непосредственно перед проведением опытов готовили серию разведений исследуемых соединений концентрацией от 10-2 М до 10-5 М, при этом растворы концентрацией 10-2 М готовили в диметилформамиде, а остальные в дистиллированной воде. В полипропиленовых пробирках объемом 0,5 мл фирмы "Ерреndorf" смешивали 10 мкл раствора исследуемого соединения с 10 мкл LВ-среды, содержащей около 500 бактериальных клеток, и выдерживали при 20°С в течение 15 минут. Затем 20 мкл бактериальной культуры с помощью автоматической пипетки с полипропиленовым наконечником наносили на слой агара в центре чашки тщательно растирали по всему слою агара изогнутой стеклянной палочкой. Агар не содержал антибиотика. Чашки выдерживали 18 часов при 37°С и подсчитывали абсолютное число выросших колоний. Концентрацию бактериальных клеток подбирали таким образом, чтобы иметь до 500 колоний на чашке.

  1.  
    1. Обсуждение результатов

1.3.1. Исследование возможности применения селенсодержащих 1,5 - дикетонов для лечения ожогов

Для применения ДАФС-25 и хлорсодержащих 1,5-дикетонов в качестве препаратов для лечения ожогов необходимо было испытать его действие на животных, которые имели обожженные участки кожи. В качестве объекта исследования были взяты беспородные белые мыши-самцы со средней массой 20 г.

Для проведения опытов по принципу аналогов из беспородных белых мышей-самцов были сформированы четыре опытные и одна контрольная группы животных.

Первая группа белых мышей была контрольной, им после ожогананосилась повязка с мазью «Левомеколь».

На следующей день после нанесения ожога у мышей контрольнойгруппы отмечалась вялость, сильная заторможенность. Рана покрылась плотным ожоговым струпом. Площадь поверхности ожога составила 1,7 см2. Смерть наступила на 3-й день экперимента. Таким образом, применяемая для лечения ожогов мазь «Левомеколь» не оказывает достаточно эффективного влияния на процесс заживления ран.

Для изучения свойства препаратов 1,5-дифенил-3,3-дихлор-3-селена-пентадиона-1,5 (ДАФС-25) и 1,5-ди-(п-хлорфенил)-3-селенапентандиона-1,5 нивелировать эффект, вызванный контактным ожогом, сформировали 4 опытные группы.

Животным первой опытной группы (рис.1) наносился контактный ожог III степени. Затем через 1 час эксперимента перорально вводили препарат ДАФС-25, растворенный в соответствующем объеме масла (800 мкг/кг). После этого на рану накладывалась чистая сухая марля и перевязка не проводилась, по мере заживления ожога марля отваливалась сама.

На следующий день после нанесения ожога у мышей первой опытной группы отмечалась вялость, заторможенность, затруднение дыхания. Площадь поверхности ожога составила 1,7 см2. На 3-й день эксперимента рана покрылась ожоговым струпом и наступила смерть.

   

Рис. 1. – Группа № 1

(1-й день эксперимента)

Рис.2. – Группа № 2.

(1-й день эксперимента)

   

Рис.3. – Группа № 3.

(1-й день эксперимента)

Рис.4. – Группа № 1.

(2 – й день эксперимента)

Животным второй опытной группы наносился контактный ожог III степени, а на перевязках накладывалась повязка с препаратом ДАФС-25. У этих животных на следующий день после нанесения ожога наблюдалась относительная бодрость. Рана покрылась тонким ожоговым струпом. На 3-й день эксперимента вокруг раны хорошо была видна краевая эпителизация. Площадь поверхности ожога составила 1,4 см2. На 4-й день эксперимента наступила смерть.

Животным третьей опытной группы, в количестве 5 мышей самцовнаносился контактный ожог III степени. Затем через 1 час экспериментаперорально вводили препарат 5-ди-(п-хлорфенил)-3-селенапентандион-1,5, растворенный в соответствующем объеме масла (800 мкг/кг). У мышей третьей опытной группы отмечалась вялость, заторможенность, рана покрылась ожоговым струпом. Площадь поверхности ожога составила 1,6 см2. На 2-й день эксперимента наступила смерть.

Животным четвёртой опытной группы в количестве 5 мышей самцовнаносился контактный ожог III степени, а на перевязках наносилась повязка с препаратом 5-ди-(п-хлорфенил)-3-селенапентандиона-1,5.

   

Рис.5. – Группа № 2. (2 – день эксперимента)

Рис.6. - Группа № 3.

(2 – день эксперимента)

У этих животных на следующей день после нанесения ожога наблюдалась заторможенность, затруднение дыхания, на ране вздулся пузырь, заполненный темной жидкостью. На 3-й день эксперимента наступила смерть, на ране хорошо был заметен тонкий ожоговый струп. Отмечалось начало краевой эпителизации. Площадь поверхности ожога составила 1,5 см2.

   

Рис.7. – Группа № 1

(3-й день эксперимента)

Рис.8. – Группа № 2.

(3-й день эксперимента)

Таким образом, применение селеноорганических препаратов ДАФС-25 и 5-ди-(п-хлорфенил)-3-селенапентандиона-1,5 с нанесением на ожоговую поверхность положительно влияет на заживление кожи беспородных белых мышей-самцов. Однако при пероральном использовании этих препаратов положительных результатов не наблюдалось.

1.3.2. Исследование цитотоксической активности некоторых солей тяжелых металлов на клетки

Нами также проведены исследования цитотоксической активности некоторых селеноорганических соединений, так как бактериальные клетки являются одной из простых и надежных живых тест-систем.

Рис.9. – Группа № 3 (3-й день эксперимента)

Рис. 10. – Группы № 1,2,3 (сравнение). 3-й день эксперимента

Следует отметить, что вероятность критерия соответствия для исследуемых соединений при концентрациях 10-5 - 10-4 моль/л была больше 0,75 в случае клеток Е.соli С-600 и К-12, что указывает на отсутствие выраженного цитотоксического действия изученных селеноорганических соединений. Таким образом, для Е.соli НВ-101 достоверно обнаруживается антибактериальное действие препаратов 2, 3, 5 при концентрациях 10-2 - 10-5 М и соединения 4 при концентрациях 10-2 - 10-4 М. Для штаммов Е.соli С-600 антибактериальным действием обладали соединения: 2 при концентрациях 10-2 - 10-4 М; 3, 5 и 4 при концентрации 10-2 М; 1 в концентрациях 10-2 -10-4М. Клетки Е.соli К-12 подвержены антибактериальному действию соединения 2 при концентрациях последнего 10-2 - 10-5 М, соединения 3(10-2 -10-4 М), вещества 5 (10-2 - 10-3 М), соединения 4 (10-2 - 10-4 М), препарата 1 при концентрации 10-2 М.

Таким образом, обнаружена взаимосвязь между строением селено-органического соединения и его цитотоксическим действием.

В случае Е.соli К-12 большей активностью обладало соединение 2.Антибактериальная активность соединений 3 и 4 на всех клетках Е.соli НВ-101, С-600, и К-12 отличалась незначительно и была низкой.

Можно предположить, что различия в цитотоксическом действиисоединений 2 и 5 на разные штаммы Е.соli зависит от строения клеточнойстенки и от возможности проникновения внутрь клетки. Обнаруженная цитотоксическая активность соединений селеноксантилия и селенопирилия предполагает разработку новых препаратов, которые обладали бы выраженными антибактериальными свойствами и были бы лишены факторов мутагенности.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В настоящее время селеноорганические соединения применяются в качестве биологически-активных добавок для восполнения недостатка селена в организме человека, в качестве энтеросорбентов. Широко их применение в технике в качестве фотоактивных и фоточувствительных материалов. Однако область применения их в составе ранозаживляющих покрытий только развивается. Поэтому в дальнейшем целесообразно работать над созданием препаратов меньшей токсичности для применения в комбустиологии.

ВЫВОДЫ

Обнаружено, что препарат ДАФС-25 оказывает положительное влияние при лечении ожогов, причем эффективно его применение в виде мази, при пероральном введении препарата не обнаружено положительного эффекта. Для более эффективного лечения ожогов препаратом ДАФС-25 необходима разработка лекарственной формы с большим кожно-резорбтивным действием.

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ

1. Барабой В.А. Механизмы стресса и перекисное окисление липидов// Успехи соврем. биол. - 1991. - Т 111, вып. 6. - С. 923-931.

2. Тутельян В.А., Княжев В.А., Хотимченко С.А. и др. Селен в организме человека: метаболизм, антиоксидантные свойства, роль в канцерогенезе. М.: Изд-во РАМН, 2002. - 221 с.

3. Burk R.F., Hill K.E., Motley A.K. Selenoprotein metabolism and function: evidence for more then one function for selenoprotein P// J. Nutr. - 2003. - Vol. 133, № 5. - P. 15175-15205.

4. Gamble S.C., Wiseman A., Goldfarb P.S. Selenium-dependent glutathione peroxidase and other selenoproteins - their synthesis and biochemical role // J. Chem. Techn. Biotechn. - 1997. - Vol. 68. - P. 123-134.

5. Lee B.J., Park J.M. et al. Molecular biology of selenium and its role in human health // Mol. Cells. - 1996. - Vol. 6. - P. 509-520.

6. Islam F., Zia S., Sageed I. et al. Effect of selenium on lipids, lipid peroxidation, and sulfhydryl group in neuroendocrine centers of rats // Biol. Trace Elem. Res. - 2004. - Vol. 97, № 1. - P. 71-81.

7. Longnecker M.P., Stram D.O., Taylor P.R. et al. Use of selenium concentration in whole blood, serum, toenails or urine as a surrogate measure of selenium intake // Epidemiology. - 1996. - Vol. 7. - P. 384-390.

8. Low S.C., Harney J.W. Cloning and functional characterization of human selenophosphate synthetase, an essential component of selenoprotein synthesis // J. Biol. Chem. - 1995. - Vol. 270. - P. 21 659 - 21 664.

9. Книжников В.А., Комлева В.А., Тутельян В.А. и др. Влияние повышенного поступления органического селена с диетой на резистентность крыс воздействию ионизирующего излучения, афлатоксина В1 и инфекции // Вопр. Питания. 1991, № 4, С. 52 – 55.

10. Traulsen H., Steinbrenner H., Buchezyk D.P. et al. Selenoprotein P protects low-density lipoprotein aganst oxidation // Free Radic. Res. - 2004. - Vol. 38, № 2. - P. 123-128.

11. Salble A.D., Morris V.C. Selenium content of rat hair, nails and other tissues is affected by concurrent exposure to toxik elements // Nutr. Res. 1993, Vol.13, P. 31-36.

12. Swanson C.A., Patterson B.H. et al. Human [74Se]selenomethionine metabolism: a kinetik model // Am. J. Clin. Nutr. 1991, Vol. 54, P. 917-926.

13. Голубкина Н.А., Мазо В.К., Гмошинский И.В. и др. Гомеостаз селена при экспериментальной анафилаксии у крыс на фоне приема восстановленного глутатиона и селенообогащенной спирулины// Вопр. мед. химии. - 2000. - № 1. - С 28-32.

14. Голубкина Н.А., Соколов Я.А., Хотимченко С.А. и др. Селенообогащенные дрожжи Saccharomyces cerevisiae // Биотехнология. - 1996. - № 5. - С. 52-56.

15. Пат. № 2171110 РФ. А 61 К 33/04. Средство для лечения и профилактики инфекционных за­болеваний и отравлений / Древко Б.И., Древко Р.И., Антипов В.А., Чернуха Б.А., Яковлев А.Н. / Опублик. в Бюл. № 21 за 2001.

16. Патент 2051681 РФ А 61К 33/04. Средство для лечения и профилактики болезней, вызываемых недостаточностью селена / Древко Б.И., Антипов В.А., Жуков О.И. и др./ Опублик. в Бюлл. №1 за 1996 г.

17. Руденко С.С., Бондарь Б.М., Кухаркин О.Л. и др. Влияние селена на функциональное состояние почек крыс при отравлении алюминием и кадмием // Укр. Биохим. журн. - 1998. - Т. 70, № 6. - С. 98-105.

18. Stewart M.S., Spallbolz J.E., Neldner K.H., Pence B.C. Selenium compounds have disparate abilities to impose oxidative stress and induce apoptosis // Free Radic. Biol. Med. - 1999. - Vol. 26, № 1-2. - P. 42-48.

19. Гигиенические критерии состояния окружающей среды.58. Селен. –Женева: Всемирная организация здравоохранения. – 1989. – 270 с.

20. Владимиров Ю.А., Шерстнев М.П., Азимбаев Т.К. Оценка антиокислительной и антирадикальной активности веществ биологических объектов // Биофизика. - 1992. - Т. 37. - С. 1041-1047.

17