XXVI Международный конкурс научно-исследовательских и творческих работ учащихся

Старт в науке

Влияние азотофиксирующих бактерий на развитие растений на инертных средах

• Авторы
• Руководители
• Файлы работы
• Наградные документы

Конев А.А. 1

---

1МКОУ Краснозерский лицей №2 имени Ф.И.Анисичкина

Жетыгелденова С.Т. 1

---

1МУНИЦИПАЛЬНОЕ КАЗЕННОЕ ОБЩЕОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ КРАСНОЗЕРСКОГО РАЙОНА НОВОСИБИРСКОЙ ОБЛАСТИ «КРАСНОЗЕРСКИЙ ЛИЦЕЙ № 2 ИМЕНИ Ф.И. АНИСИЧКИНА» (МКОУ Краснозерский лицей № 2 имени Ф.И. Анисичкина)

Работа в формате PDF

2.2 MB

Автор работы награжден дипломом победителя I степени

Диплом школьникаСвидетельство руководителя

В современных условиях развития сельского хозяйства проблема повышения урожайности культурных растений и оптимизации использования минеральных удобрений становится особенно актуальной. Одним из перспективных направлений решения этой задачи является использование азотофиксирующих бактерий, которые могут значительно снизить потребность растений в азотсодержащих удобрениях. Использование азотофиксирующих бактерий позволяет сократить применение химических удобрений, что положительно сказывается на качестве продукции и окружающей среде.

На сегодняшний день установлено, что азотофиксирующие бактерии не только способны обеспечивать растения азотом, но и производят фитогормоны, антибиотики, активируют иммунитет растений и усиливают их устойчивость к неблагоприятным факторам окружающей среды.

Цель исследовательской работы: изучить влияния микробиологических удобрений на всхожесть семян, рост и развитие пшеницы, редиса и салата на инертных средах.

Задачи исследовательской работы:

1. Выявить особенности почв, взятых для исследования.

2. Получить штаммы Azotobaсter из почв.

3. Изучить особенности роста и развития пшеницы, редиса и салата при добавлении микробиологических удобрений.

4. Определить характер влияния штамма на величину надземной биомассы пшеницы.

5. Изучить влияние штамма на состояние корней.

Объекты исследования: почва, пшеница, редис, салат и азотобактер.

Гипотеза исследования: скорость роста и развития пшеницы, редиса и салата увеличивается при добавлении микробиологических удобрений.

Азотофиксирующие бактерии способны преобразовывать атмосферный азот (N₂) в аммонийные соединения (NH₄⁺), доступные для усвоения растениями. Это особенно важно в условиях ограниченного азотного питания, характерного для инертных сред.

Основные группы азотофиксирующих бактерий:

• Облигатные симбионты (Rhizobium, Bradyrhizobium) – вступают в симбиотические отношения с бобовыми растениями.

• Ассоциативные азотфиксаторы (Azospirillum, Herbaspirillum) – колонизируют корневую зону различных растений, включая злаковые.

• Свободноживущие азотфиксаторы (Azotobacter, Beijerinckia) – фиксируют азот без обязательного взаимодействия с растениями.

Одними из наиболее часто применяемыми в составе удобрений микроорганизмами являются ассоциативные азотофиксирующие бактерии Azotobacter. Это грамотрицательные, аэробные, свободноживущие, которые могут длительное время находится в почве, а при неблагоприятных условиях образовывать цисты и сохраняться в этом состоянии в течение ещё более длительного периода. Использование азотфиксирующих бактерий в качестве биоудобрения может привести к стимулированию роста растений путем повышения эффективности усвоения определенных питательных веществ из окружающей почвенной среды, либо путем выработки фитогормонов, которые оказывают положительное влияние на рост и развитие надземной и подземной части растений.

Клетки бактерий рода Azotobacter относительно крупные (1—2 мкм в диаметре), обычно овальные, но обладают плеоморфизмом, то есть могут иметь разную форму — от палочковидной до сферической. На микроскопических препаратах клетки могут располагаться одиночно, парами, неправильными скоплениями или, изредка, цепочками различной длины. Формируют особые покоящиеся формы — цисты, не образуют спор.

Все виды азотобактера аэробны. При отсутствии связанных форм азота азотобактер фиксирует молекулярный азот. Активные культуры связывают 15 - 20 мг азота на 1 г потребленного органического вещества. Азотобактер способен использовать большой набор органических соединений - моно- и дисахариды, некоторые полисахариды (декстрин, крахмал), многие спирты, органические кислоты, в том числе ароматические. Вообще азотобактер проявляет высокую потребность в органических веществах, поэтому в больших количествах встречается в хорошо удобренных почвах.

Наиболее изучены: A. chroococcum, A. beigerinckii, A. vinelandii и A. Paspali. Перечисленные виды различаются по размерам и форме клетки, а также по некоторым другим признакам, в частности пигментации колоний. Так, колонии A. chroococcum имеют бурый, почти черный цвет, A. vinelandii выделяют желтый пигмент зеленой флуоресценции, A. paspali так же продуцируют желтый пигмент. В почве чаще всего встречается A. сhroococcum.

Оптимум pH для роста и фиксации азота 7,0—7,5, также способны расти в диапазоне pH от 4,8 до 8,5. Представители рода растут на безазотистых средах, предназначенных для выделения свободноживущих азотфиксирующих и олигонитрофильных организмов, например, на среде Эшби, содержащей источник углерода (маннит, сахароза или глюкоза) и необходимые микроэлементы (источник фосфора, серы и т. д.), или на среде М. В. Фёдорова, содержащей больше микроэлементов, а также на жидкой среде Бейеринка. На плотных питательных средах представители рода образуют плоские, слизистые колонии пастообразной консистенции диаметром 5—10 мм, в жидких питательных средах образуют плёнки. Характерно также пигментирование, колонии представителей рода могут быть окрашены в тёмно-коричневый, зелёный и других цветов, или же могут быть бесцветными в зависимости от видовой принадлежности. Представители рода Azotobacter являются мезофильными микроорганизмами и растут при температуре 20—30 °C.

Представители рода Azotobacter распространены повсеместно в нейтральных и слабощелочных почвах и обычно не выделяются из кислых почв. Также представители рода Azotobacter были выделены из водных местообитаний, в том числе из пресноводных водоёмов, солоноватоводных болот.

На основе азотофиксирующих бактерий производятся микробиологические удобрения, которые важны при беспочвенном выращивании растений. Микробиологические удобрения – это удобрения, содержащие микроорганизмы, которые способны мобилизовать питательные вещества из почвы, превращая их из сложной органической и недоступно­й для растений формы посредством биологических процессов в простую неорганическую и удобную для поглощения корневой системой. Кроме этого, в результате своей жизнедеятельности микроорганизмы могут синтезировать и выделять активирующие вещества, которые оказывают положительное влияние на рост и стрессоустойчивость наземных растений.

Азотофиксирующие бактерии применяются в гидропонных системах для снижения потребности в минеральных удобрениях. Например, исследования показывают, что Azospirillum brasilense и Azotobacter vinelandii могут способствовать росту томатов и салата в гидропонных растворах. Эксперименты с пшеницей и кукурузой, выращенными на вермикулите с инокуляцией Azospirillum sp., продемонстрировали увеличение биомассы растений на 15–30% по сравнению с контролем без бактерий. Созданы коммерческие биопрепараты на основе азотофиксирующих бактерий, такие как "Азотовит" (на основе Azotobacter chroococcum), которые улучшают рост культур в беспочвенных системах.

Вермикулит и перлит широко используются в сельском хозяйстве и гидропонике в качестве инертных субстратов, обеспечивающих оптимальные условия для корневой системы растений. Они различаются по своим физико-химическим свойствам, что влияет на рост растений, особенно при использовании азотофиксирующих бактерий.

Вермикулит – это гидратированный алюмосиликат, который подвергается термической обработке, в результате чего образуется легкий, пористый материал с высокой влагоемкостью и хорошей аэрацией. Удерживает в 3-4 раза больше воды, чем свой вес, обеспечивая растения стабильным водоснабжением. Поддерживает стабильную кислотность, что важно для развития корневой системы. Способствует развитию корневых волосков, увеличивая площадь всасывания воды и питательных веществ. Вермикулит создает благоприятную среду для роста микроорганизмов, удерживая влагу и питательные вещества.

Перлит – вулканическое стекло, подвергнутое термической обработке для образования пористых гранул. Характерна высокая воздухопроницаемость – предотвращает застой воды, снижая риск корневой гнили; низкая плотность – облегчает корневой рост и улучшает проникновение кислорода, химическая инертность – не выделяет ионы, не изменяет pH среды.

2. Практическая часть

На первом этапе работы нужно приготовить почву для исследования. В июле были взяты образцы почвы в четырёх локациях по три повторности на одинаковой глубине (5-15 см). Участками были берёзовые колки в 8-10 км от рп Краснозерское. В лаборатории почва была высушена. Исследованы особенности структуры почв, изучена ризосфера и присутствие животных в почвах. Почвы богаты листовым опадом.

2. 1. Исследование механического состава почвы

Методика определения механического состава почвы:

1)Для определения механического состава нужно насыпать 1 столовую ложку почвы в ладонь;

2) с помощью пипетки Пастера к почве необходимо прилить воду и тщательно перемешать воду с почвой до получения как можно более вязкого “теста”;

3) из полученного “теста” следует скатать шарик диаметром 2-3 см и попробовать растянуть его в жгут.

Результаты: исследованные почвы по механическому составу – среднесуглинистые и тяжелосуглинистые.

2. 2. Определение кислотности среды почвенной вытяжки. Определяли с помощью универсальной индикаторной бумаги.

Определение pH почвенной вытяжки:

1.Заполнить половину объёма пробирки типа “эппендорф” исследуемым образцом почвы;

2. Оставшийся свободный объём пробирки заполнить водой;

2. Пробирку плотно закрыть крышкой;

3. Перемешать содержимое пробирки, интенсивно встряхивая пробирку в течение 5 минут;

4. Дождаться полного осаждения взвеси почвы на дно пробирки;

5. Опустить индикаторную бумагу в почвенную вытяжку и по шкале определить рН.

Результаты исследования кислотности почвы. Показатели рН = 5-6,5. Слабокислая среда.

2.3. Определение содержания органического вещества.

Приготовили 2% и 5% растворы пищевой соды, поместили в них образцы почвы и по шкале определили содержание органического вещества.

Результат: содержание органического вещества во всех локациях большое, около 2000 мг/кг.

2.4. Посев и наблюдение за ростом колоний бактерий Аzotobacter

Вторым этапом работы было выращивание и получение азотофиксирующих бактерий из почвы методом почвенных комочков на среде Эшби.

Приготовление среды Эшби (200 мл):

1. На химических или бытовых весах подготовить навески:

1. 1 г CaCO₃;

2. 3 г агара;

3. 4 г глюкозы;

2. В химический стакан налить 200 мл вспомогательного раствора;

3. В стакан с раствором перенести навески CaCO₃, агара и глюкозы;

4. Смесь в стакане перемешать до состояния однородной взвеси;

5. Вскипятить содержимое стакана на плите или в микроволновой печи до максимального растворения компонентов (часть взвеси не растворится, но большая часть компонентов должна образовать густой однородный раствор);

2. Смесь охладить до 50-60 и заполнить ей чашки Петри так, чтобы смесь полностью покрывала дно (потребуется ~20-25 мл на одну чашку).

Посев:

1. Из увлажнённой почвы отделить 40-50 комочков диаметром ~3-4 мм;

2. Чашку Петри, заполненную застывшей средой, разместить на трафарете, совместив края чашки с контуром трафарета;

3. В чашке Петри в узлах трафарета разместить подготовленные комочки земли;

4. Чашки Петри накрыть крышками и оставить на 3-4 дня при комнатной температуре.

При культивировании на среде Эшби (которая не содержит доступных источников азота) различные штаммы азотобактеров (Azotobacter spp.) проявляют характерные морфологические особенности колоний.

Внешний вид колоний разных видов Azotobacter

Результаты. Во всех образцах почвы появились бактерии. Процент обрастания 70-90%. В основном колонии бактерий небольшие, поверхность гладкая, край колонии ровный, сначала молочные, потом коричневые, рост медленный. Также выросли колонии, у которых цвет колонии через 10 дней стал желтоватым.

Затем провели микроскопической исследование образцов.

2. 5. Микроскопическое исследование образцов.

С помощью зубочистки взяли небольшое количество биомассы колонии бактерий, перенесли на предметное стекло. С помощью пипетки Пастера на предметное стекло в центр площади, покрытой образцом, нанесли каплю фуксина Циля, затем каплю туши. Зубочисткой перемешали красители и биомассу, находящиеся на стекле, до равномерного тонкого слоя грязно-розового цвета. На препарат нанесли каплю воды и изучили полученный препарат с помощью светового микроскопа при увеличении x100 и x 400

2. 5. Н а среде Эшби вырастили «чистые культуры».

Результаты через три дня.

2. 5. В ыращивание редиса, пшеницы и салата с азотобактером на инертных субстратах.

Схема опыта.

Исследования проводили в лабораторных условиях. В качестве субстрата использовали агроперлит и вермикулит. Опыт состоял из двух вариантов: контроль (полив дистиллированной водой без азотобактера) и опыт (полив дистиллированной водой с азотобактером). Каждый вариант включал по две повторности по 20 семян. Постоянная температура в помещении 24 градуса.

Результаты с пшеницей

Результаты с редисом

Результаты с салатом

П шеница. Третий день. Пшеница. Четырнадцатый день.

Р едис. Третий день. Редис. Четырнадцатый день.

Салат. Третий день. Салат. Четырнадцатый день.

Пшеница. Агроперлит. Пшеница. Вермикулит.

С азотобактером и без С азотобактером и без

Редис. Агроперлит. Редис. Вермикулит.

С азотобактером Без С азотобактером Без

Салат. Агроперлит. Салат. Вермикулит.

С азотобактером Без С азотобактером Без

Результаты: Общее число проростков, средняя длина листьев и корней немного больше при использовании азотобактера.

Выводы и общие результаты:

1. Почва, из которой получили азотофиксирующие бактерии для исследований, по механическому составу среднесуглинистая, слабокислая, с достаточно большим содержанием органического вещества. Азотофиксирущих бактерий в данной почве много, это показывает процент обрастания (до 70%).

2. По внешнему виду обрастания почвенных комочков, по микроскопическим исследованиям получены азотофиксирующие бактерии.

3. Результаты показали, что растения, обработанные азотофиксирующими бактериями, демонстрировали: увеличение скорости роста по сравнению с контрольной группой; улучшение корневого развития и листьев.

4. Оба субстрата – и вермикулит, и агроперлит - подошли для выращивания растений. При их применении нужно учитывать, что вермикулит уплотняется, а агроперлит нужно чаще поливать и перед применением лучше промыть.

5. Применение азотофиксирующих бактерий на инертных средах способствует улучшению роста растений за счёт биологической фиксации азота. Это открывает перспективы для использования таких микроорганизмов в сельском хозяйстве, особенно в условиях ограниченных ресурсов почвы.

Список использованных источников и литературы:

1. Инструкции по использованию набора «Оценка влияния факторов окружающей среды на рост растений»

2. Методические рекомендации к стартовому набору: сбор и первичное исследование образцов почвы. /Всероссийский атлас почвенных микроорганизмов/.

3. Методические рекомендации и инструкции по применению набора «Охотники за микробами»

4. https://biomolecula.ru/articles/odisseia-azota

5. https://elementy.ru/nauchnopopulyarnaya_biblioteka/435886/Nauka_v_rukakh_shkolnika_sibirskie_okhotniki_za_mikrobami

6. https://ru.wikipedia.org/wiki/Азотобактер