CRISPR/Cas9: революция в генной инженерии и этические проблемы её применения

XXVI Международный конкурс научно-исследовательских и творческих работ учащихся
Старт в науке

Личный портфель

CRISPR/Cas9: революция в генной инженерии и этические проблемы её применения

Гущина С.К. 1Арсентьева А.М. 1
1МАОУ "СОШ №41 г. Челябинска"
Савельева О.К. 1
1МАОУ "СОШ №41 г. Челябинска"
Автор работы награжден дипломом победителя III степени
Диплом школьникаСвидетельство руководителя
Текст работы размещён без изображений и формул.
Полная версия работы доступна во вкладке "Файлы работы" в формате PDF

ВВЕДЕНИЕ

С самого открытия структуры ДНК Джеймсом Уотсоном и Фрэнсисом Криком человечество стремилось не только понять, но и научиться целенаправленно изменять генетический код живых организмов. Мечта о редактировании генов, подобно правке текста в текстовом редакторе, долгое время оставалась областью научной фантастики. Однако в начале XXI века эта мечта стала реальностью с появлением технологии CRISPR/Cas9 – инструмента, который произвел подлинную революцию в биологии, медицине и генной инженерии.

Актуальность темы данного проекта неоспорима. CRISPR/Cas9 – это технология, обладающая потенциалом коренным образом изменить наше будущее. С ее помощью ученые получили невиданный ранее инструмент для точечного, быстрого и относительно дешевого редактирования геномов. Это открывает колоссальные перспективы для лечения наследственных заболеваний, борьбы с раком и вирусными инфекциями (включая ВИЧ), а также для создания новых сортов сельскохозяйственных растений и пород животных, устойчивых к болезням и изменению климата.

Однако вместе с беспрецедентными возможностями пришли и беспрецедентные этические вызовы. Способность вмешиваться в фундаментальный код жизни ставит перед человечеством серьезные моральные и философские вопросы. Главная проблема заключается в том, где провести черту между лечением тяжелых болезней и так называемым «улучшением» человека, созданием «дизайнерских детей» с заданными свойствами.

Целью данного проекта является комплексный анализ технологии CRISPR/Cas9: от изучения ее молекулярных механизмов до оценки социально-этических последствий ее применения.

Для достижения этой цели в работе поставлены следующие задачи:

1) Изучить историю открытия и механизм работы системы CRISPR/Cas9.

2) Проанализировать современные применения технологии в медицине и биологии.

3) Выявить этические проблемы и социальные последствия генного редактирования.

4) Обсудить регуляторные аспекты и возможные будущие направления развития технологии.

Объект исследования: технология редактирования генома CRISPR/Cas9.
Предмет исследования: научные принципы работы CRISPR/Cas9 и этико-правовые аспекты ее применения.

Методы исследования: Анализ научной литературы, обобщение данных из рецензируемых статей и обзоров, систематизация информации по этическим аспектам.

Глава 1: Научные основы технологии CRISPR/Cas9

1.1 История открытия и развития

CRISPR-Cas9 – это передовая система редактирования генов, которая сыграла революционную роль в генетических исследованиях и приложениях. Эта технология позволяет ученым с высокой точностью добавлять, удалять или изменять генетический материал в клетках живых организмов. CRISPR сейчас известен как точный инструмент для изменения генов, но до его открытия ученые долгое время пытались понять его природу и возможности.

CRISPR был открыт доктором Дженнифер Даудна из Калифорнийского университета в Беркли (Калифорния, США) и доктором Эммануэль Шарпантье из Института физики Общества Макса Планка (Мюнхен, Германия). Важная работа ученых, которая показала, что система CRISPR-Cas9 может быть использована для изменения генов, была опубликована в 2012 году. За свое открытие женщины получили Нобелевскую премию по химии в 2020 году.

Другие важные ученые, сделавшие свой вклад в развитие технологии, включают Фенга Чжана из Института Броуда, который первым применил CRISPR в клетках высших организмов, и Джорджа Черча из Гарвардской медицинской школы, который показал работу CRISPR в человеческих клетках. Доктор Франциско Мохика из Испании первым идентифицировал CRISPR как часть бактериальной защиты и предложил название механизму. Работа Франциско в 1993 году и последующие эксперименты других ученых привели к тому, что CRISPR стал использоваться как мощный инструмент для редактирования генов. С момента адаптации Даудной и Шарпантье технология CRISPR быстро развивалась и нашла применение в различных областях, от медицины до сельского хозяйства. В ноябре 2023 года, инструмент редактирования генов получил первое клиническое одобрение в Великобритании для лечения серповидноклеточной анемии и бета-талассемии – болезней крови, вызванных одной генетической ошибкой. Американское Управление по контролю за качеством пищевых продуктов и лекарственных препаратов (Food and Drug Administration, FDA) также одобрило терапию для серповидноклеточной анемии и готовится вынести решение по бета-талассемии к марту следующего года [2].

1.2 Молекулярный механизм

CRISPR работает, используя систему, которая напоминает «память» бактерии о вирусах, с которыми она сталкивалась в прошлом. Бактерии собирают кусочки ДНК вирусов и хранят их в своем собственном геноме в виде CRISPR-последовательностей. Когда тот же вирус пытается атаковать бактерию снова, CRISPR использует «сохраненнную» ДНК как шаблон, чтобы распознать и разрезать вирусную ДНК, предотвращая инфекцию. В лабораторных условиях ученые адаптировали такой механизм для целенаправленного изменения генов. Специалисты создают РНК-проводник, который соответствует специфическому участку в ДНК целевого организма. Проводник приводит фермент Cas9 к этому участку, где он делает точный разрез. После разреза клетка пытается восстановить повреждение, и в этот момент ученые могут вносить изменения в геном, например, удаляя, заменяя или добавляя генетический материал [2].

Механизм работы системы CRISPR/Cas9:

Шаг 1: Сканирование ДНК. Комплекс Cas9 + gRNA движется вдоль молекулы ДНК. Белок Cas9 проверяет каждую последовательность на наличие мотива PAM.

Шаг 2: Узнавание PAM. Как только Cas9 находит последовательность PAM (например, 5'-GGG-3'), он временно раскручивает двойную спираль ДНК непосредственно перед этим мотивом.

Шаг 3: Образование «рибонуклеопротеинового комплекса» и гибридизация.

1) Комплекс Cas9-gRNA «примеряет» участок crRNA (из gRNA) к последовательности ДНК, расположенной прямо перед PAM.

2) Если последовательность полностью комплементарна участку crRNA, происходит образование водородных связей (гибридизация).

Шаг 4: Активация и разрез

1) Точное совпадение между gRNA и ДНК вызывает конформационное изменение (изменение формы) белка Cas9.

2) Это изменение активирует два каталитических домена белка Cas9 – HNH и RuvC.

3) HNH-домен разрезает цепь ДНК, комплементарную crRNA.

4) RuvC-домен разрезает вторую, некомплементарную цепь ДНК.

5) В результате в ДНК образуется двуцепочечный разрыв (DSB)

Шаг 5: Реакция клетки на разрыв. Клетка воспринимает двуцепочечный разрыв как чрезвычайную ситуацию и пытается его «залатать». Для этого существует два основных пути:

1. Негомологичное соединение концов (NHEJ)

Процесс: клетка сшивает разорванные концы ДНК. Этот процесс часто приводит к вставке (инсерции) или удалению (делеции) нескольких нуклеотидов.

Результат: Выключение гена (нокаут). Если в результате вставки (делеции) происходит сдвиг рамки считывания (frameshift). В результате происходит сдвиг рамки считывания при транскрипции мРНК.), ген полностью перестает работать.

2. Точное восстановление ДНК (HDR)

Процесс: если исследователи предоставили клетке матрицу – часть ДНК с желаемой мутацией, окруженный гомологичными участками, клетка может использовать её как чертеж для «правильного» исправления разрыва.

Результат: Точечное редактирование (редакция гена). Можно внести конкретную мутацию, вставить новый ген или исправить ошибку.

На основании этих данных и используя современные цифровые технологии, нами был создан поэтапный механизм работы системы CRISPR/Cas9 [Приложение 1].

Новая версия технологии CRISPR / Cas9 построена по образу и подобию естественной системы редактирования генома, используемой бактериями в качестве иммунной защиты.

Технология CRISPR/Cas9 повторяет механизм иммунной защиты бактерий, которые, заражаясь вирусом, встраивают фрагмент его ДНК в свой геном (матрицу CRISPR) для последующего распознавания и уничтожения этого вируса при повторной атаке.

Исследователи из Калифорнийского университета разработали невирусный способ доставки CRISPR/Cas9, повышающий эффективность редактирования генов. В отличие от дорогих, сложных в масштабировании и потенциально токсичных вирусов, новый метод использует межцепочечные сшивки (ICLs).

ICLs – это повреждения ДНК, которые «сшивают» две нити её спирали, блокируя репликацию и транскрипцию (что используется, например, в химиотерапии для остановки деления раковых клеток). Учёные обнаружили, что добавление ICLs в процесс редактирования в три раза повысило его эффективность и стимулировало восстановление ДНК, при этом не увеличив частоту ошибок, что стало неожиданным и значимым результатом [10].

Глава 2: Применение CRISPR/Cas9 в медицине и биологии

2.1 Генная терапия наследственных заболеваний

Геномное редактирования – новый подход, широко применяемый в генной терапии и исследованиях по функциональной геномике. В основе метода лежит использование специфичных нуклеаз, способных вызывать сайт - специфические изменения геномов. Данная область исследования развивается стремительно, уже 5-10 лет после открытия метода появляются работы по успешному применению их у человека.

Для лечения наследственных заболеваний методами геномного редактирования традиционно используют два подхода: генную (in vivo) и клеточную терапию (ex vivo). Суть генной терапии заключается во введении в живую клетку нуклеиновых кислот или из производных, которые либо изменяют структуру гена путем встраивания в ДНК клетки-хозяина, например, при лентивирусной трансдукции, либо восполняют недостаток мРНК гена, например, функционируя в виде плазмиды, либо модифицируют экспрессию гена, например, подавляя путем РНК - интерференции в случае использования малых интерферирующих РНК [3].

2.2 Борьба с инфекционными заболеваниями

Технология CRISPR-Cas9 демонстрирует высокий потенциал в терапии ВИЧ-инфекции, реализуемый через три основные стратегии.

Первая направлена на подавление и удаление интегрированного вируса. Нацеливание системы на гены вируса и регуляторные последовательности (LTR) позволяет эффективно ингибировать репликацию ВИЧ. Исследования подтвердили, что CRISPR-Cas9 может не только разрушать неинтегрированный вирус, но и вырезать провирусную ДНК из генома инфицированных клеток. Успешное удаление провируса было продемонстрировано in vivo на мышиных моделях с использованием системы доставки на основе аденоассоциированного вируса (AAV), что открывает путь к клиническим испытаниям.

Вторая, наиболее перспективная стратегия, это блокирование проникновения ВИЧ в клетку путем редактирования генов ко-рецепторов CCR5 или CXCR4. Модификация CCR5 по аналогии с естественной мутацией CCR5Δ32 придает клеткам (включая макрофаги и Т-лимфоциты) устойчивость к вирусу. Важно, что функциональная активность отредактированных Т-клеток при этом сохраняется.

Таким образом, CRISPR-Cas9 предлагает мощный инструментарий для борьбы с ВИЧ, как путем прямого уничтожения вирусного генома, так и через создание генетически устойчивых к инфекции клеток организма [7].

2.3 Нейробиология и создание моделей

CRISPR/Cas9 открывает новые возможности для создания моделей нейродегенеративных заболеваний на животных, что особенно ценно для изучения расстройств, вызванных генетическими мутациями. В отличие от традиционных методов, ограниченных отсутствием линий эмбриональных стволовых клеток, CRISPR/Cas9 позволяет напрямую редактировать гены в эмбриональном геноме. Это особенно важно для крупных животных, чьи модели точнее воспроизводят клинические симптомы человека.

Технология также является мощным инструментом терапии: она может подавлять экспрессию мутантных генов, облегчая неврологические симптомы. Например, при болезни Гентингтона можно targeted воздействовать на мутировавший гентингтин в уязвимых нейронах, а при болезни Паркинсона — снижать экспрессию мутантного α-синуклеина через NHEJ-опосредованную инактивацию генов в дофаминергических нейронах. Кроме того, CRISPR/Cas9 позволяет заменять мутантные гены нормальными последовательностями посредством HDR, хотя эффективность такой замены пока невысока. Тем не менее, система остаётся многообещающим подходом для создания точных моделей заболеваний и их будущей терапии [5].

Глава 3: Этические проблемы и социальные последствия

3.1 Редактирование зародышевой линии человека

Редактирование зародышевой линии (также инжиниринг зародышевой линии человека) – редактирование генома индивида таким образом, что изменение становится наследственным. Использование редактирования зародышевой линии для воспроизведения запрещено законом более чем в 40 странах и международным договором в рамках Совета Европы. Однако такие исследования продолжаются в КНР. Результат достигается за счет генетических изменений в половых клетках или репродуктивных клетках, таких как яйцеклетка и сперматозоид. Этот вид генетической модификации напрямую манипулирует геномом с использованием методов молекулярной инженерии.

Помимо инженерии зародышевой линии, возможна и соматическая генетическая модификация – изменение соматических клеток, то есть тех клеток организма, которые не участвуют в размножении. Хотя соматическая генная терапия изменяет геном клеток-мишеней, эти клетки не относятся к зародышевой линии, поэтому изменения не являются наследственными и не могут быть переданы следующему поколению [9].

3.2 «Дизайнерские дети» и евгеника

Дизайнерский ребёнок – это эмбрион или плод, чей генетический состав был намеренно выбран или изменён, часто для исключения определённого гена или удаления генов, связанных с заболеваниями, чтобы добиться желаемых характеристик. Этот процесс обычно включает преимплантационную генетическую диагностику (ПГД), в ходе которой анализируется множество человеческих эмбрионов для выявления генов, связанных с определёнными заболеваниями и характеристиками, а затем выбираются эмбрионы с желаемым генетическим составом. В то время как скрининг отдельных генов широко распространен, полигенный скрининг становится все более популярным, хотя в настоящее время его предлагают лишь несколько компаний. Этот метод использует алгоритм для суммирования предполагаемого влияния многочисленных генетических вариантов на риск развития у человека определенного заболевания или признака. Другие методы изменения генетической информации ребенка предполагают прямое редактирование генома до рождения с использованием таких технологий, как CRISPR. Спорный пример этого можно увидеть в деле 2018 года, связанном с китайскими близнецами Лулу и Наной, чьи геномы были отредактированы для защиты от ВИЧ-инфекции, что вызвало широкую критику и юридические споры. [1]

3.3 Регуляция и международное отношение

Технология CRISPR/Cas9, несущая потенциал для лечения тяжелых болезней, сталкивается с проблемой отсутствия глобального регулирования. Ключевой этической дилеммой является риск коммерциализации и создания «дизайнерских детей», что может привести к генетическому неравенству.

Разработку терапий затрудняют сложные патентные законы, дорогие клинические испытания и разнородные национальные законодательства. Международные организации (ВОЗ, ЮНЕСКО) предлагают этические кодексы, но они должны оставаться гибкими. Многие эксперты настаивают на международном запрете на внеклиническое использование технологии из-за непредсказуемых социальных последствий [6].

Глава 4: Перспективы и вызовы

4.1 Технические вызовы

Некоторые технические вызовы технологии CRISPR-Cas9:

1) Офф-таргет-эффекты. Одно из основных ограничений – непреднамеренное редактирование, когда фермент Cas9 случайно разрезает нецелевые участки ДНК. Это может привести к мутациям с непредсказуемыми последствиями [8].

2) Ошибки репарации ДНК. Даже если «разрез» точен, починка ДНК часто идёт не по плану. Наиболее распространённый механизм восстановления склонен к ошибкам, а результат редактирования может не соответствовать задуманному [4].

3) Сложности с доставкой компонентов системы CRISPR в клетки. Эффективная доставка всех необходимых компонентов CRISPR-Cas9 в клетки и ткани организма остаётся сложной задачей. 

4) Низкая эффективность внесения желаемых генетических изменений. В некоторых случаях эффективность может быть низкой, особенно в клетках и тканях с низкой активностью деления. 

5) Экологические последствия. Применение CRISPR для редактирования генов у диких видов, например, для борьбы с вредителями или заболеваниями, может иметь непредсказуемые экологические последствия [8].

6) Для решения этих и других проблем исследователи пытаются разработать более эффективную систему редактирования, например, путём модификации фермента Cas9, изучения рабочего домена нуклеазы и других методов [4].

4.2 Будущие применения

Прецизионное редактирование без разреза. Одно из направлений развития CRISPR – создание систем, которые модифицируют ген без полного разреза ДНК, снижая вероятность off-target эффектов.

Генная терапия в клинике. Многие биотехнологические компании проводят клинические испытания, где с помощью CRISPR/Cas9 корректируют мутации у пациентов с редкими наследственными болезнями или формируют противоопухолевый иммунитет.

Агропромышленный сектор. CRISPR/Cas9 активно применяется в сельском хозяйстве. Генетическое редактирование культурных растений может повысить их устойчивость к болезням, вредителям и неблагоприятным условиям окружающей среды.

Персонализированная медицина. В будущем развитие CRISPR/Cas9 может способствовать индивидуальному подходу к лечению, когда врачам достаточно будет получить генетический профиль пациента, выявить патогенные мутации и целенаправленно их скорректировать. Такой сценарий предусматривает тесную интеграцию новых технологий с широкомасштабными генетическими исследованиями и биоинформатикой [6].

4.3 Социально-этические

Этические опасения относились не только к экспериментам на эмбрионах, но и к весьма непростой перспективе генной инженерии человека. Благодаря CRISPR-Cas9, появилась теоретическая возможность вносить генные изменения в половые клетки (сперматозоиды и яйцеклетки), которые будут могут быть переданы будущим поколениям.

Упомянутые вопросы не ускользнули от внимания ученых. Некоторые соглашаются, что инженерия человека – это минное поле этических проблем, и считают, что любые исследования с использованием CRISPR-Cas9 на человеческих эмбрионах должны быть запрещены. Другие, однако, уверены, что полный мораторий на подобные изыскания будет не только сложен на практике, но и вреден для научного прогресса. Несмотря на такую разницу во взглядах, научное сообщество сходится в том, что лучшее решение – это открытый публичный диалог, что подтверждается многочисленными совещаниями и конференциями, посвящёнными этой теме, по всему миру [6].

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Проведенное исследование позволяет утверждать, что технология CRISPR/Cas9 стала поистине переломным моментом в истории биологии и медицины. Эта система, позаимствованная у бактерий, предоставила ученым инструмент невиданной точности, простоты и доступности для целенаправленного редактирования генома. Ее потенциал в лечении наследственных заболеваний, борьбе с раком и ВИЧ, а также в решении продовольственных проблем трудно переоценить. CRISPR/Cas9 открывает путь к принципиально новым методам терапии, которые еще недавно казались фантастикой.

Однако главный вывод работы заключается в том, что колоссальные возможности технологии порождают не менее масштабные этические и социальные вызовы. Способность вмешиваться в человеческий геном, особенно в зародышевую линию, стирает грань между лечением и «улучшением» человека, создавая реальную угрозу возникновения «дизайнерских детей» и углубления социального неравенства. Эксперимент Хэ Цзянькуя наглядно продемонстрировал, что научное сообщество и общество в целом не готовы к неконтролируемому применению таких мощных инструментов.

Между тем, CRISPR-Cas9 продолжает развиваться. Фармацевтические компании инвестируют в этот метод ради новых исследований в области дизайна лекарств, так что технические недостатки находят и исправляют.

Во многих странах обсуждаются законопроекты и рекомендации по ограничению использования CRISPR/Cas9 в репродуктивных технологиях. Международные организации (Всемирная организация здравоохранения, ЮНЕСКО) разрабатывают этические принципы и кодексы, которые должны стать основой для контроля за подобными исследованиями.

В заключение, CRISPR/Cas9 – это не просто инструмент, а своего рода зеркало, отражающее наши ценности, страхи и надежды.

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ

  1. https://translated.turbopages.org/proxy_u/en-ru.ru.d50d473c-68cc3d77-fd6ba81e-74722d776562/https/en.wikipedia.org/wiki/Designer_baby (дата обращения: 21.08.25)

  2. https://www.securitylab.ru/analytics/546771.php?ysclid=mfrv85dzw7820266805 (дата обращения: 21.08.25)

  3. Smirnikhina Svetlana, V. Lavrov Alexander: Генная терапия наследственных заболеваний с помощью технологии CRISPR/Cas9 in vivo - https://www.researchgate.net/publication/309058194_Gennaa_terapia_nasledstvennyh_zabolevanij_s_pomosu_tehnologii_CRISPRCas9_in_vivo

  4. translational-medicine.biomedcentral.comscience.mail.ru (датаобращения: 22.08.25)

  5. Weili Yang, Qiang Sun. CRISPR/Cas9: возможности моделирования и терапии нейродегенеративных заболеваний - https://www.frontiersin.org/journals/molecular-neuroscience/articles/10.3389/fnmol.2016.00030/full (дата обращения: 26.08.25)

  6. Генетическое редактирование (CRISPR/Cas9): инновации, перспективы и этические аспекты - https://medgorod-clinic.ru/stati/geneticheskoe-redaktirovanie--crispr-cas9---innovatsii--perspektivy-i-eticheskie-aspekty/?ysclid=mfrw116ri391461268

  7. Зиганшин А. М., Мулюков А. Р. ACTA BIOMEDICA SCIENTIFICA, 2023, Vol. 8, N 1, ПЕРСПЕКТИВЫ ПРИМЕНЕНИЯ СИСТЕМЫ CRISPR-Cas9 В ЛЕЧЕНИИ ВИРУСНЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ ЧЕЛОВЕКА - https://cyberleninka.ru/article/n/perspektivy-primeneniya-sistemy-crispr-cas9-v-lechenii-virusnyh-zabolevaniy-cheloveka/viewer (дата обращения: 31.08.25)

  8. Инновации в редактировании генов: CRISPR и за его пределами. –https://studwork.ru/spravochnik/nauchpop/innovacii-v-redaktirovanii-genov-crispr-i-za-ego-predelami - https://studwork.ru/spravochnik/nauchpop/innovacii-v-redaktirovanii-genov-crispr-i-za-ego-predelami?ysclid=mfy0n7oo4774217822 (дата обращения: 23.08.25)

  9. Редактирование зародышевой линии - https://ru.ruwiki.ru/wiki (дата обращения: 28.08.25)

  10. Шевцев Никита: Редактирование генов вышло на новый уровень: встречайте CRISPR, которому не нужны вирусы - https://www.techinsider.ru/news/news-1594385-redaktirovanie-genov-vyshlo-na-novyi-uroven-vstrechaite-crispr-kotoromu-ne-nujny-virusy (дата обращения: 20.08.25)

ПРИЛОЖЕНИЕ 1

Механизм работы системы CRISPR/Cas9

 

Точное совпадение между gRNA и ДНК вызывает изменение формы белка Cas9. ꞊> Активация двух каталитических доменов Cas9 – HNH (разрезает цепь ДНК, комплементарную crRNA) и RuvC (разрезает вторую, некомплементарную цепь ДНК) ꞊> образование двуцепочечного разрыва (DSB)

Шаг 4: Активация и разрез

Шаг 3: Образование «рибонуклеопротеинового комплекса» и гибридизация

двуцепочечный разрыв (DSB)

RuvC-домен

HNH-домен

RuvC-домен

HNH-домен

Комплекс Cas9-gRNA «примеряет» участок crRNA из gRNA к последовательности ДНК. Если последовательность полностью комплементарна участку crRNA ꞊> гибридизация

гибридизация

crRNA

рибонуклеопротеиновый

комплекс

мотив РАМ

временно раскручивает двойную спираль ДНК

Шаг 2: Узнавание РАМ

Молекула ДНК

Комплекс Cas9 gRNA

Шаг 1: Сканирование ДНК

инсерция

 

делеция

делеция

ДНК

гомологичные участки

Матрица

желаемая мутация

внесение конкретной мутации, вставка нового гена или исправление ошибок

Точечное редактирование (редакция гена)

Выключение гена (нокаут)

сдвиг рамки считывания (FramShift)

инсерция

инсерция

Точное восстановление ДНК (HDR)

Негомологичное соединение концов (NHEJ)

Шаг 5: Реакция клетки на разрыв

Просмотров работы: 41