XXVIII Международный конкурс научно-исследовательских и творческих работ учащихся

Старт в науке

ВВЕДЕНИЕ petunia hybrida В КУЛЬТУРУ IN VITRO

• Авторы
• Руководители
• Файлы работы
• Наградные документы

Фаблинова В.И. 1

---

1Научно-учебная лаборатория «Агрокуб» МБОУ «СШ №1 г. Вельска» имени Г.Д. Карпеченко

Фаблинова А.А. 1

---

1Научно-учебная лаборатория «Агрокуб» МБОУ «СШ №1 г. Вельска» имени Г.Д. Карпеченко

Работа в формате PDF

2.2 MB

Автор работы награжден дипломом победителя II степени

Диплом школьникаСвидетельство руководителя

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность

Петуния гибридная – популярная, широко культивируемая во всем мире. Важную роль в тиражировании гибридной петунии имеет микроклональное размножение in vitro, поскольку жизнеспособность и качество посевного материала резко ухудшается в последующих поколениях.

Немаловажный аспект при этом – существенное снижение экономических затрат.

Гипотеза технология микроклонального размножения petunia hybridia - как способ оздоровления посадочного материала для озеленения территории нашей школы.

Цель работы: ввести petunia hybridia в культуру in vitro и применить технологию микроклонального размножения как современного способа оздоровления посадочного материала для озеленения территории.

Цель исследовательской работы обусловила решение следующих задач представленных на экране:

1.Изучить методику технологии клонального размножения растений;

2.Отборать черенки от маточного растения petunia hybrida;

3. Освоить этапы введения в стерильные условия;

4.Получить оздоровленные растения-регенеранты с развитой корневой системой;

5.Адаптировать растения к естественным условиям произрастания;

Глава I.ТЕОРЕТИЧЕСКАЯ ЧАСТЬ

1.1 Клональное микроразмножение – это использование техники in vitro для быстрого получения неполовым путем растений, идентичных исходному. По своей сути микроклональное размножение аналогично вегетативному типу размножения растений с той лишь разницей, что оно протекает в пробирке в условиях in vitro, где из клеток изолированных тканей в итоге можно получить достаточно большое количество растений. Асептические условия и соответствующие питательные добавки позволяют в случае необходимости уменьшить размер экспланта до нескольких миллиметров. В настоящее время число видов растений, которые можно клонировать «в пробирке» уже составляет около одной тысячи. Хотя метод микроклонального размножения растений является довольно трудоемким и затратным, в ряде случаев на его основе уже стало возможным создавать экономически рентабельные технологии.

Фруктовые, декоративные, ягодные растения в основном являются гетерозиготными, поэтому при их размножении семенами генотип исходного растения утрачивается. Генетически идентичные растения могут быть получены при клональном размножении.

Клон – все потомство одного индивидуума, полученное в результате неполовой репродукции. В природных условиях клональное размножение осуществляется при апомиксисе или при вегетативном размножении (корневищами, клубнями, луковицами, видоизмененными побегами, черенками). [1]

1.2 Этот метод имеет ряд преимуществ перед существующими традиционными способами размножения:

 высокий коэффициент размножения (105 –106 – для травянистых, цветочных растений, 104 –105 – для кустарниковых древесных, 104 – для хвойных);

 возможность проведения работ в течение года и экономия площадей, необходимых для выращивания посадочного материала;

 получение генетически однородного посадочного материала;

 освобождение растений от вирусов за счет использования меристемной культуры;

 ускорение перехода растений от ювенильной к репродуктивной фазе развития;

 сокращение продолжительности селекционного процесса;

 получение растений, трудно размножаемых традиционными способами;

 возможность автоматизации процесса выращивания.

Области применения клонального микроразмножения разнообразны и имеют тенденцию к расширению:

 в селекции для поддержания и размножения растений с уникальными генотипами;

 для быстрого размножения новых и уже существующих сортов;

 массового получения оздоровленного посадочного материала у растений, подверженных вирусным заболеваниям;

 для быстрого размножения некоторых гетерозиготных садовых культур, обычно размножающихся семенами и расщепляющихся при скрещивании;

 для быстрого клонального размножения in vitro лучших экземпляров взрослых древесных растений, разведение и селекция которых осуществляется медленно вследствие длительности процесса полового размножения;

 для сохранения редких и исчезающих видов.

Основное требование к объектам, которые используются для микроклонального размножения, это сохранение генетической стабильности на всех этапах онтогенеза. Этому требованию удовлетворяют апексы и пазушные почки стеблевого происхождения. Для микроклонального размножения также могут быть использованы меристематические ткани и изолированные органы, способные давать адвентивные почки. Такие почки могут развиваться на корнях, побегах и листьях.

Методы культивирования изолированных фрагментов растений основаны на использовании важного свойства растительной клетки –тотипотентности.

Тотипотентность (лат. Totus – весь, potentia – сила) – это свойство клетки реализовать генетическую информацию, обеспечивающую ее и развитие до целого организма. [1]

1.3 Существует много методов клонального микроразмножения, и различными авторами предлагаются разные системы их классификации.

Наиболее распространенной является классификация, согласно которой микроклональное размножение может осуществляться за счет:

 активации развития уже существующих в растении меристем (апекса стебля, пазушных и спящих почек, интеркалярных зон стебля);

 индукции адвентивных почек непосредственно тканями экспланта;

 индукции соматического эмбриогенеза;

 дифференциации адвентивных почек в первичной и пересадочной каллусной тканях.

Основной метод, используемый при клональном микроразмножении растений, – это активация развития уже существующих в растении меристем. Он основан на снятии явления апикального доминирования, что может быть достигнуто следующими путями:

а) удалением верхушечной меристемы стебля и последующим микрочеренкованием побега на безгормональной среде;

б) добавлением в питательную среду веществ цитокининового типа действия, индуцирующих развитие многочисленных пазушных побегов.

Для этого используют БАП или кинетин, а также 2- изопентениладенин и зеатин. Полученные побеги отделяют первичного материнского экспланта и вновь культивируют на свежеприготовленной питательной среде, стимулирующей пролиферацию пазушных меристем и возникновение побегов более высоких порядков.

1.4 Процесс клонального микроразмножения можно разделить на несколько этапов:

1–й этап – выбор растения донора, изолирование и стерилизация экспланта, создание условий для его роста на питательной среде in vitrо;

2–й этап – собственно размножение, осушествляемое одним из четырех перечисленных выше способов;

3–й этап – укоренение размноженных побегов;

4–й этап – высадка растений–регенерантов в почву.

На первом этапе необходимо добиться получения хорошо растущей стерильной культуры. При этом, как правило, используют среду, содержащую минеральные соли по прописи Мурасига и Скуга, а также различные биологически активные вещества и стимуляторы роста (ауксины, цитокинины) в различных сочетаниях в зависимости от объекта. Продолжительность первого этапа – от 1 до 2 месяцев.

На втором этапе важно достигнуть получения максимального количества микроклонов. Как и на первом этапе, используют питательную среду по рецепту Мурасига и Скуга. Основную роль при подборе оптимальных условий культивирования эксплантов играют соотношение и концентрация внесенных в питательную среду цитокининов и ауксинов. Из цитокининов наиболее часто используют БАП в концентрациях от 1 до 10 мг/л, а из ауксинов – ИУК и НУК в концентрациях до 0,5 мг/л. При длительном культивировании растительных тканей в питательных средах с повышенным содержанием цитокининов (10 мг/л) происходит постепенное накопление их в тканях выше необходимого физиологического уровня, что приводит к формированию растений с измененной морфологией.

Третий этап является наиболее трудоемким, поскольку от него во многом зависит успех клонального микроразножения. На данном этапе, как правило, меняют основной состав среды. Уменьшают в два, а иногда и в четыре раза концентрацию минеральных солей в среде Мурасига и Скуга, снижают концентрацию сахара до 0,5–1 % и полностью исключают цитокинины, оставляя лишь ауксины. В качестве стимулятора корнеобразования используют ИМК, ИУК или НУК.

Укоренение микропобегов проводят двумя способами:

 выдерживание микропобегов в течение 2–24 ч в стерильном концентрированном растворе ауксина (20–50 мг/л) с последующим их культивированием на агаризованной среде без гормонов или непосредственно в подходящем почвенном субстрате (импульсная обработка);

 культивирование микропобегов в течение 3–4 недель непосредственно на питательной среде, содержащей ауксин в невысоких концентрациях (1–5 мг/л).

В последнее время предложен пока еще мало практикуемый метод укоренения пробирочных растений в условиях гидропоники. Этот метод позволяет значительно упростить этап укоренения и одновременно получать растения, адаптированные к естественным условиям. Пересадка растений-регенерантов в субстрат является ответственным этапом, завершающим процесс клонального микроразмножения. Наиболее благоприятное время для пересадки пробирочных растений – весна или начало лета. Растения с двумя–тремя листьями и хорошо развитой корневой системой осторожно вынимают из колб или пробирок пинцетом с длинными концами или специальным крючком. Корни отмывают от остатков агара и высаживают в почвенный субстрат, предварительно простерилизованный при 85–90 °С в течение 1–2 ч. Горшочки с растениями помещают в теплицы с регулируемым температурным режимом (20–22 °С), освещенностью не более 5 тыс. лк и влажностью 65–90 %. Для лучшего роста растений создают условия искусственного тумана. В тех случаях, когда нет возможности создать такие условия, горшочки с растениями накрывают стеклянными банками или полиэтиленовыми пакетами, которые постепенно открывают до полной адаптации растений. Процесс адаптации пробирочных растений к почвенным условиям является наиболее дорогостоящей и трудоемкой операцией. Нередко после пересадки растений в почву наблюдается остановка в росте, опадение листьев и их гибель. Это связано, в первую очередь, с тем, что у пробирочных растений нарушена деятельность устьичного аппарата, вследствие чего происходит потеря большого количества воды. Во– вторых, у некоторых растений в условиях in vitro не происходит образования корневых волосков, что приводит, в свою очередь, к нарушению поглощения воды и минеральных солей из почвы. Поэтому целесообразно на третьем и четвертом этапах клонального микроразмножения применять искусственную микоризацию растений (для микотрофных), учитывая их положительную роль в снабжении растений минеральными и органическими веществами, водой, биологически активными соединениями, а также в защите растений от патогенов. При разработке методов клонального микроразмножения растений необходимо учитывать влияние генетических, физиологических, гормональных и физических факторов. Это связано с тем, что методика, разработанная для определенного клона одного вида не всегда может быть применена для размножения других представителей этого вида и тем более растений другого вида.

1.4 Петуния (petuniahybrida)

Пету́ния или Петунья (лат. Petunia от фр. petun табак) - род травянистых или полу-кустарниковых многолетних растений семейства Паслёновые (Solanaceae), высотой от 10 см до 1 метра. Происходит из тропических регионов Южной Америки, главным образом Бразилии, в естественных условиях растёт в Парагвае, Боливии, Аргентине и Уругвае.

Ботаническое описание

Многолетние и однолетние травы и кустарники.Стебли прямостоячие или стелющиеся густоветвистые, образующие побеги второго и третьего порядков. Встречаются как низкие (20—30 см), так и высокие (60—70 см) виды. Побеги округлые, зелёные, опушённые простыми и железистыми волосками.Листья сидячие, очередные, разной величины, разнохарактерные по форме и размеру, цельнокрайные, опушённые.

Цветки обычно крупные, часто одиночные, могут обладать неприятным запахом, простые или махровые, на коротких цветоножках, отходящих от пазух листьев. Цветок актиноморфный, с двойным околоцветником, состоящим из чашечки и венчика. Чашечка пятираздельная из пяти чашелистиков, сросшихся у основания на ¹⁄₅ или ¹⁄₆ длины. Чашелистики узкие или широкие, зелёные, густоопушённые. Венчик спайнолепестный, воронкообразный, из пяти лепестков, звездчатой или правильной формы. Цвет венчика может быть белым, красным или синим (или цвет образован сочетанием красных и синих пигментов различной интенсивности; при этом наличие жёлтого или оранжевого цвета в лепестках свидетельствует, что культивар относится к другому роду калибрахоа). Трубка длинная или короткая, узкая или широкая, сидит свободно на чашечке. Тычинок четыре—пять, которые до половины срослись с трубкой. Пыльники парные, удлинённые, тычиночные нити длинные.Завязь верхняя, одногнёздная, семяпочек много. Столбик длинный, тонкий, прямой. Рыльце воронкообразное, бугристое, края ровные. Плод петунии — двустворчатая коробочка, растрескивающаяся при созревании семян. Семена петунии очень мелкие. [2]

1. 1. 1. Петуния Мамбо F1.

Высота взрослых растений от 15 см (в горшках) до 25 см (о/г).
Компактные кусты цветут парадоксально крупными для карликов цветками диаметром 8-9 см и выглядят роскошными цветущими шарами. Декоративность серии не страдает в ненастную погоду. Кустики стабильно сохраняют привлекательный вид, не вытягиваются. 

1.4.2 Петуния Тайдал Вейв Черри F1.

Высотой до 55 см, длина побегов до 1,5 м, цветки диаметром 5 – 6 см ярко-розовой окраски. мощный рост (высота куста может достигать 50 см и более, а длина побегов – до 1,5 м), обильное ветвление, крупные цветки (обычно 5 – 6 см в диаметре), раннее цветение, отменное здоровье и устойчивость к неблагоприятным условиям. [3]

1.4.3 Петуния Опера Суприм F1.

Высота10–20 см, диаметр куста может достигать 120-150 см. Цветки диаметром 5–7 см, с гладкой поверхностью и краями, расположены по всей длине побегов. Серия ампельных гибридных петуний, отличающихся обильным и продолжительным цветением, устойчивостью к непогоде и неприхотливостью в уходе.  [4]

1.4.4 Петуния Дебонэйр Черри Блэк F1.

Растения образуют очень плотные, шарообразные кусты, высотой 25-38 см, диаметром 25-30 см, усыпанные многочисленными цветками, диаметром 6-8 см. с необычной окраской. [5]

Глава II. Практическая часть

Оборудование и вещества необходимое для выращивания культуры «in vitro»:

1. Стерильное помещение (лаборатория) ;

2. Ламинар – бокс;

3.Сухожарочный шкаф для стерилизации посуды и инструмента;

4. Дистиллятор;

5.Стеклянные пробирки (банки);

6. Фитостеллаж;

7. Гидропоника;

8. Автоклав;

9. Лабораторные весы;

10. Холодильник;

11. pH-метр;

12. Магнитная мешалка с подогревом;

13.Электрическая плита и др.,

Работа выполнена в научно-учебной лаборатории «Агрокуб»

имени Г.Д. Карпеченко.

2.1. Исследование по размножению цветочно-декоративных растений проводилось с 4 декабря 2025 года по настоящее время по следующей схеме:

1. Отбор маточного растения (Петуния Тайдал Вейв F1, Петунияя Мамбо F1, Петуния Опера Суприм и Петуния Дебонейр Черная вишня F1), не имеющего признаков заражения. (Рисунок 1 и 2)

2. Стерилизация инструментов и оборудования. Стерилизацию помещения проводят УФ-лампой. Инструменты и посуда (комплект: скальпель+ пинцет + чашка Петри) обработанные предварительно этиловым спиртом стерилизуются в сухожаровом шкафу упакованные в пергаментной бумаге течение 60 минут при температуре 100-130 градусов.

3.Приготовление питательной среды по Среда Мурасиге и Скуга, рН 5,6-5,8. (Приложение № 1.) Питательную среду разливаем в стеклянные пробирки и банки и закрываем ватно-марлевыми пробками и перманентной бумагой поверх стерилизуем в автоклаве при температуре 121 градус -1.1-1.2. атм., в течении 20 минут. (Рисунок 3)

4.Подготовка ламинарного бокса. При работе в ламинаре поверхность протирается 96% спиртом, после чего включается УФ излучение на 30 минут.

5.Получение стерильной культуры.

Отбор здоровых образцов от маточных растений (черенков и семян). Освобождение образцов от инфекций (бактерии, грибы) в ламинар-боксе путем промывания в проточной воде. Далее помещением образцов в 70% спирт на 1 минуту, затем в раствор белизны (1 ч. белизны и 2 части воды) на 15 минут. Промывание эксплантов и семян от дезенфицирующих растворов путем помещения образцов в стерильную дистиллированную воду дважды. Для семян используем специальные мешочки. Введение эксплантов в культуру in vitro на питательную среду.(Рисунок 4)

6.Культивирование на стеллажах при определенном освещении и фотопериоде и повышенной влажности до 96%, температуре +25-28 С) .(Рисунок 5)

7. Получение растений - регенеранты. (Рисунок 6)

6.Разбивка регенерантов на микрочеренки (клоны), с возможным максимальным коэффициентом размножения.

7. Пассаж микрочеренков (клонов на питательную среду) с последующим культивированием растений и разбивкой на клоны.

8. Перенос растений на гидропонную установку с питательным раствором Кнопа.

9. Перенос растений в почву. (Рисунок7)

2.2 Результаты исследований.

Дата исследования с 4 декабря 2025 по настоящие время

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

1)Мы получили посадочного материала в разы больше по сравнению с традиционными способами причем бесплатно, так как использовали в качестве донора -прошлогоднее маточное растение petuniahybridia.

2)Условия реализации позволили не затрачивать дополнительные средства на рабочую силу и расходные средства, так как

работы проводились обучающимися НУЛ «Агрокуб» в процессе реализации программы дополнительного образования по освоению техники микроклонального размножения растений;

• в процессе занятий мы не только увеличили объем посадочного материала, но и получили новые знания в области современной биотехнологии;

РЕАЛЬНЫЙ ЗАКАЗЧИК: МБОУ «Средняя школа № 1 г.Вельска»

Польза проекта:

• озеленение территории и входной группы школы без дополнительных расходов;

• профориентация школьников возможность примерить на себя будущие профессии: биотехнолог, садовник, ландшафтный дизайнер, лаборант и другие;

ПОТЕНЦИАЛЬНЫЙ ЗАКАЗЧИК:Городская администрация

• Польза проекта:

• Импортозамещение посадочного материала озеленение городских парков, скверов и др., с наименьшими затратами;

• поддержка имиджа района, в котором находится одна из семи в России научно-учебная лаборатория «Агрокуб» им. Г. Д. Карпеченко

ПЕРСПЕКТИВЫ ПРОЕКТА:

• Это проект перехода от ежегодных закупных расходов к собственному высокотехнологичному производству посадочного материала высшего качества.

• Мы не просто экономим бюджет, мы формируем узнаваемый бренд района как цента биотехнологий, создавая базу для озеленения, образования и туризма.

По итогам нашем работы наша гипотеза подтвердилась, технология микроклонального размножения petunia hybridia - как способ оздоровления посадочного материала для озеленения территории нашей школы.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Petunia hybrida продемонстрировала высокие темпы регенерации на безгормональной питательной среде МС, выражающиеся в достаточной скорости роста и развития растений, хорошем ризогенезе, а также коэффициенте размножения 5,7.

Для микроклонального размножения петунии целесообразно использовать черенки пробирочных растений, которые помещают на безгормональную среду МС. Пробирочные растения Petunia hybrida обладают высокой приживаемостью, более 60% в почвенном субстрате, что свидетельствует о высокой пластичности культуры. (Рисунок 8)

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ:

1.(Л. А. ПЕРШИНА ) ОСНОВНЫЕ МЕТОДЫ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ in vitro В БИОТЕХНОЛОГИИ РАСТЕНИЙ;

2.https://ru.ruwiki.ru/wiki/Петуния?ysclid=mn31igfylg809381210#Ботаническое_описание;

3. https://www.kp.ru/family/sad-i-ogorod/petuniyatajdal/?ysclid=mn32jmtwb8619161033;

4. https://tomatipomidori.ru/petuniya-opera-suprim-parpl-veyn/;

5.https://biotechnica-spb.ru/catalog/petuniya-mnogocvetkovaya/petuniya-mnogocvetkovaya-debonejr-f-1-blek-cherri?ysclid=mn32vr0qs6942728764;

П
риложения

Среда по Мурасиге и Скуга рН 5,6-5,8

Рисунок 1. Гибриды петуний

Рисунок 2. Отбор первичных эксплантов

Рисунок 3. Приготовление питательной среды по Мурасиге и Скуга

Рисунок 4. Стерилизация растительного материала при введении 

в культуру in vitro

Рисунок 5.Культивирование на фитослеллажах

Рисунок 7.Вывод из invitro

Рисунок 8.Результат