XXIX Международный конкурс научно-исследовательских и творческих работ учащихся

Старт в науке

Получение микробиома из ЖКТ личинки zophobas morio на искусственной среде

• Авторы
• Руководители
• Файлы работы

Мальков А.Ю. 1

---

1МБОУ "Куртамышская средняя общеобразовательная школа №1"

Немкова Е.А. 1

---

1МБОУ "Куртамышская средняя общеобразовательная школа №1"

Работа в формате PDF

245.1 KB

Информационная карта проекта

Введение

Земля строила себя миллиарды лет, за это время организмы активно изменялись от цианобактерий до высочайших папоротников, от гигантских рыб до еще более больших динозавров, они эволюционировали, появлялись и умирали, после чего их тела и растительность опустились на немыслимую глубину под породы. И вдруг приходит человек и вместо останков деревьев, бактерий и животных находит там черную маслянистую жидкость - нефть.

Нефть моментально подросла на рынке, и сейчас нефть это самый востребованный ископаемый ресурс, из него делают множество нефтепродуктов, пластмассы, масла и топливо. Люди придумали как использовать ее во всех сферах жизни, но не подумали о том что в будущем это приведёт к ужасным последствиям.

В настоящее время ископаемые запасы нефти исчерпаны на 60％, одновременно с этим мы столкнулись с важной проблемой, загрязнение планеты пластиковым мусором. Современный мир трудно представить без пластиковых изделий. Оглядевшись по сторонам, можно увидеть массу предметов из пластмассы, будь - то пишущая ручка, бутылка с водой или обычный полиэтиленовый пакет, который мы покупаем каждый раз, когда идем в супермаркет. Именно этот пакет и стал причиной возникновения микропластика, гигантских свалок, и пластиковых островов. Люди, очевидно стараясь загладить свою вину, придумывают “ЭКО-акции” сбор пластмасс для утилизации, но в мире за год перерабатывается всего 40 млн тонн пластика в год, а на планете его сейчас свыше 8 тыс мегатонн и с каждым годом это число растет. Такими темпами наша планета никогда не будет отчищена от пластика полностью. Но наверное, все же есть способ повлиять на эту проблему, использовать для микроорганизмы для утилизации пластиковых отходов.

Объект исследования: личинки жуков Zophobas morio и бактерии обитающие в их ЖКТ.

Предмет исследования: Способность бактерий-симбионтов из ЖКТ личинок Zophobas morio разлагать полимеры под действием ферментов

Цель работы: Выделить изоляты разных родов бактерий из общего микробиома ЖКТ личинок zophobas morio, для дальнейшего изучения способности этих изолятов к биодеградации полимеров.

Нами были поставлены следующие задачи:

1. Получить культивируемый спектр микробиома на неселективной среде

2. Разделить колонии на группы по морфологическим признакам

3. Высеять разделенные группы на скошенный агар для получения чистой накопительной культуры.

Актуальность: В последнее время перед человечеством стоит одна из самых важных и значимых проблем, загрязнение окружающей среды синтетическими полимерами и нефтепродуктами такими как мазут, вторичные масла, дизельное топливо, Керосин ну и, конечно же, пластик которого по данным из научного журнала “Ланцет” опубликованного британскими учеными в 2025 году накопилось более 8 тыс. мегатонн, пластик скопился на свалках и в водах мирового океана, качественная его переработка не представляется возможной. За один год в мире используется 5 триллионов одноразовых пластиковых пакетов — это около 650 пакетов на каждого жителя Земли или 160 000 пакетов в секунду. Однако, качественно переработать его очень сложно, а неправильная утилизация наносит колоссальный ущерб окружающей среде. Все это делает мою работу особенно актуальной, поскольку в рамках нее мы открываем новые возможности для разработки биологически чистых препаратов со способностью ускорять биодеградацию полимеров, на основе штаммов бактерий-симбионтов выделенных из их микробиома ЖКТ. В нашей работе мы подробно изучим и выделим микробиом на искусственной среде для дальнейшего его изучения и использования в создании биопрепаратов для ускорения биодеградации пластиковых отходов

Гипотеза: В Микробиоме из ЖКТ личинок zophobas morio содержатся культивируемые штаммы бактерий способные к ускорению биодеградации полимеров.

Методы: Теоретические: анализ и изучение информации по данной теме.

Практические: эксперимент, наблюдение, сравнение, фотографирование.

1. Теоретическая часть

1.1 Мировые и научные исследования о способности zophobas morio перерабатывать пластик

В 2021 году команда энтузиастов "Ксенос", состоящая из двух биологов и одного эколога из технопарка "Якутия" завела колонию большой восковой огневки в лаборатории и стала наблюдать, как личинка поедает пластик. Согласно исследованиям, пластик подвергается разрушению, благодаря действию внутренних бактерий личинки восковой огневки. Но потом они стали работать с жуками зофобас морио (zophobas morio) и обнаружили, что они в 3 раза быстрее поедают пластик, чем восковая огневка. Чтобы выяснить, как это происходит, их пару недель кормили только пластиком, а затем высушивали. Выяснилось, что они перерабатывают пластик на вторичные метаболиты и октакозан. Научные наблюдения показали, что достигнуть этого удавалось благодаря действию внутренних бактерий личинок жука зофобас морио [1].

В самом начале работы над своим проектам я подумал, что личинки zophobas morio идеально подойдут для моего исследования, но позже я наткнулся на статью следующего содержания.

1.2 Опровержение гипотезы о способности zophobas morio перерабатывать пластик

В НовГУ опровергли мнение о способности «суперчервей» утилизировать пластик

Ученые НовГУ экспериментально проверили, насколько крупные личинки жука Zophobas morio (те самые, что любят снимать в фильмах ужасов), могут поедать пенопласт. Оказалось, что никакого химического разложения не происходит. Вместо этого насекомые просто дробят материал, превращая его в микроскопические частицы. Вывод важен для оценки реального потенциала использования насекомых в переработке пластика, а также для понимания рисков, связанных с накоплением микропластика в экосистемах. Авторы работы ученые НовГУ, сотрудники Центра исследования проблем микропластика — Иван Зорин, Павел Челушкин, Анастасия Бурмистрова, Сергей Люлин. Результаты исследования опубликованы в журнале Polymer Science.

— Одна из рассматриваемых нами научных статей рассказывает о том, что микробиом в кишечнике Zophobas morio способен к деградации пенопласта. Это породило надежду на создание биологических методов утилизации, — рассказывает Анастасия Бурмистрова.

Личинок Zophobas morio называют суперчервями и часто используют в качестве корма для животных, а также «реквизита» для фильмов ужасов из-за их устрашающего внешнего вида. Ученые из НовГУ и СПбГУ решили проверить гипотезу о разложении пластика такими насекомыми и провели собственный эксперимент. Для него использовали личинок и куски бытового пенопласта. Насекомых разделили на три группы. Первую кормили только овсяными отрубями, вторую — смесью отрубей и пенопласта, а третью — исключительно пенопластом. Наблюдение за личинками продолжалось в течение трех недель. Оказалось, что насекомые действительно активно взаимодействовали с пенопластом, прогрызая в нем сложные системы ходов и туннелей. При этом наибольшую активность проявляли личинки, дополнительно получавшие нормальное питание — отруби. Те же, кто сидел на диете из одного пенопласта, строили туннели в пенопласте не так интенсивно и не стремились окукливаться. Косвенно это указывало на то, что насекомые голодают и берегут силы для выживания. Чтобы проверить это, ученым, в первую очередь, необходимо было выяснить — меняется ли химическая структура полистирола после контакта с личинками. Для проверки они применили комплекс современных аналитических методов: инфракрасную (FTIR) и Рамановскую спектроскопию, ядерно-магнитный резонанс (ЯМР) и гель-проникающую хроматографию (ГПХ). В случае первых двух способов образец облучают инфракрасным или лазерным излучением, и по тому, как он поглощает или рассеивает это излучение, определяют, какие химические связи в нем присутствуют.

— Мы также взвешивали личинок до и после эксперимента. Насекомые, которые ели отруби, показали наибольший средний привес — 0,092 грамма на особь. У тех, кого кормили смесью отрубей и пенопласта, этот показатель оказался на уровне — 0,096 грамма. И лишь личинки, питавшиеся только пенопластом, добавились всего 0,042 грамма. То есть они почти не росли, а, значит, не использовали полистирол в качестве пищи, — рассказала Анастасия Бурмистрова. Исследование не подтвердило гипотезу о биодеградации пенопласта насекомыми. Вместо поедания пластика, личинки просто механически дробили его. Поэтому ученые считают, что их нельзя использовать в качестве способа утилизации полистирола. Более того, они могут даже нести угрозу, разрушая материал и превращая его в потенциально опасный микропластик.

Тогда стало понятно, что использование личинок для переработки пластика – недопустимо, я начал искать выход. Мною была изучена информация о том, что личинки разлагают полимеры с помощью бактерий-симбионтов, являющихся частью микробиоты их ЖКТ. Эти бактерии могут извлекать из пластика углерод, с помощью определенных ферментов разрушая структуру полимера. [2]

1.3 Описание родов бактерий обитающих в ЖКТ личинок zophobas morio

Lactococcus Грамположительные молочнокислые бактерии. У зофобаса это один из самых массовых и стабильно присутствующих родов в кишечнике. Lactococcus сбраживает углеводы с образованием молочной кислоты, что создаёт в кишечнике кислую среду и подавляет рост потенциальных патогенов — своеобразный бактериальный «щит». Состав питательного субстрата заметно влияет на обилие этого рода: при кормлении фруктово-овощными отходами и пенопластом Lactococcus остаётся одной из доминирующих групп.

Enterococcus Ещё один род грамположительных бактерий (фylum Bacillota, ранее Firmicutes). Как и Lactococcus, постоянно присутствует в кишечнике зофобаса и входит в число его естественных симбионтов. Enterococcus — факультативный анаэроб, устойчивый к широкому диапазону условий (pH, температура, солёность). Его обилие в кишечнике личинок может зависеть от состава корма: при разведении на отходах животноводства или пищевых остатках личинки заглатывают большое количество бактерий животного происхождения, включая энтерококки. Некоторые представители рода оппортунистически патогенны для человека, но в кишечнике личинок они выполняют роль нормальной симбионтной флоры.

При переводе личинок на диету из полимеров состав микробиома резко меняется: общее разнообразие падает, но определённые группы бактерий размножаются активнее — именно те, что способны утилизировать полимер.

Pseudomonas (включая P. aeruginosa)

Грамотрицательные бактерии (фylum Pseudomonadota / Proteobacteria). Один из главных «кандидатов» на деградацию полистирола в кишечнике зофобаса. Метагеномное исследование Университета Квинсленда (2022) показало, что у Pseudomonas есть гены, связанные с расщеплением полистирола, а также ферменты класса гидролаз, использующие воду для разрыва полимерных цепей на стирольные мономеры. Ранее из кишечника зофобаса выделяли Pseudomonas sp., способные разлагать не только полиэтилен, но и полифениленсульфид — сверхпрочный промышленный пластик. Pseudomonas aeruginosa может быть и оппортунистическим патогеном: при каннибализме среди личинок она способна проникать в гемоцель и вызывать гибель хозяина. newscientist.com +2

Rhodococcus

Грамположительные бактерии (фylum Actinomycetota). Метагеномный анализ связал представителей этого рода с генами, ассоциированными с деградацией полистирола. Rhodococcus известны в микробиологии как мощные деструкторы ксенобиотиков — у них большой геном, богатый оксидоредуктазами и гидролазами, и они способны утилизировать длинноцепочечные углеводороды, воска и синтетические полимеры. В кишечнике зофобаса они, по-видимому, работают на «фронте» биодеградации полистирола. 

Corynebacterium

Грамположительные бактерии из того же типа Actinomycetota. Также отнесены к генерам, обладающим генами деградации полистирола в исследовании 2022 года. У коринебактерий описаны ферменты с активностью по отношению к стиролу и его производным. Их роль в кишечнике зофобаса, вероятно, заключается в дальнейшей утилизации продуктов первичного расщепления полимера. 

Sphingobacterium

Грамотрицательные бактерии (фylum Bacteroidota). Были указаны среди основных видов бактерий кишечника зофобаса, способных переваривать полистирол. Сфингобактерии содержат сфинголипиды в клеточной мембране (что редкость для бактерий) и известны способностью разлагать сложные органические соединения. 

Klebsiella (включая K. pneumoniae, K. aerogenes, K. oxytoca)

Грамотрицательные энтеробактерии. В одном из первых исследований по биодеградации полистирола из кишечника зофобаса был выделен штамм ZM1 с 99% генетическим сходством с Klebsiella pneumoniae. Этот штамм мог расти в среде, где единственным источником углерода был полистирол, и спектральный анализ подтвердил деградацию углеродной цепи. Другие виды — K. aerogenes и K. oxytoca — выделялись при кормлении полиизопреном и органической диетой соответственно. 

Bacillus (включая B. cereus, B. wiedmannii, B. pumilus, B. safensis)

Грамположительные спорообразующие бактерии (фylum Bacillota). Широко представлены в кишечнике зофобаса, особенно при питании синтетическими полимерами. Бациллы способны формировать биоплёнки на поверхности полимеров (например, резины и полиэтилена), секретируя внеклеточные гидролазы и оксидоредуктазы. При органической диете также выделялись B. pumilus, B. safensis и Lysinibacillus fusiformis. [3]

.

2 Практическая часть

2.1 Эксперимент 1 «Выделение общего микробного числа на BL агаре»

Предварительно все использованное оборудование и среды были стерилизованы разными способами.

 Автоклавирование в соответствии с ГОСТ при 121°С в течение 15 минут - чаши Петри, стерильный дистилят для предельных разведений, BL агар.

 Ламинар бокс стерилизовался дезинфицирующим средством + UVB-C в течение 15-30 минут.

 Все остальные предметы протирали 95% этанолом.

Работа осуществлялась в ламинар боксе без воздушного потока, в 15 см от пламени горелки.(Приложение1 рис.1)

Для начала нами было проведено вскрытие выборки из 5 шт личинок zophobas morio которых обработали 70% этанолом дважды, после вскрыли и поместили содержимое ЖКТ каждой личинки в разные эпендорфики и сделали предельные разведения с помощью стерильного дистиллята до 10^-1 После был произведен посев с помощью шпателя по 100 мкл раствора на 1 чашку Петри в 5 чашек + отрицательный контроль. Бактерии культивировались в термостате 24 часа при 28°С.

По истечению времени мы разделили полученные колонии по морфологическим признакам и описали их (таблица 1).

Таблица 1. Описание колоний бактерий из ЖКТ личинок zophobas morio

2.2 Эксперимент 2 «Посев отдельных изолятов основываясь на морфологических отличиях колоний на скошенный агар»

После того, как мы разделили колонии бактерий по морфологии, был произведен посев на скошенный агар разных колоний, различающихся по морфологическим признакам: цвет, форма и размер. Приготовленную стерилизованную BL среду поместили в пробирку, которую закупорили ватно-марлевыми пробками и поставили на автоклавирование. По окончании автоклавирования дали пробиркам остыть под углом, чтобы получился косяк (скошенная агар среда). После произвели посев и культивировали микроорганизмов в течение 24 часов при температуре 28°С.

В результате нами были получены отдельные изоляции различных по морфологии колоний, которые в дальнейшем можно будет использовать для изучения способностей этих изолятов ускорять биодеградацию полимеров.(Приложение1 рис.2)

2.3 Планируемые эксперименты

В последующих экспериментах мы будем использовать больше неселективных сред и выделять новые колонии для изучения их способностей перерабатывать полимеры и идентефицировать штаммы микроорганизмов.

Заключение

В ходе проведения эксперимента было доказано, что в ЖКТ личинки Zophobas morio находится большой спектр разных родов и видов бактерий, которые могут участвовать в биодеградации пластмасс. В дальнейшем планируется работа над изучением способностей изолятов разных колоний к биодеграции различных полимеров. На основе экспериментов в будущем, продолжим осуществлять работу над созданием биопрепарата, который можно будет потенциально использовать для ускорения переработки пластикового мусора, и докажем, что данные бактерии могут быть одним из лучших биологически чистых способов переработки пластикового мусора.

Практическая значимость:

Информация, собранная в данном проекте, может быть использована в биолабораториях для проведения исследований над биодеградацией пластика.

Список литературы и интернет-источников

1. Научные исследования о переработке пластика личинками — [Электронный ресурс]. - Режим доступа: https://дмип.рф/files/works/848_11426.pdf?ysclid=mufro9mp4326685468

2. Опровержение гипотезы о зофобасе - [Электронный ресурс]. - Режим доступа: https://www.novsu.ru/university/press/news/241551/

3. Роды бактерий — [Электронный ресурс]. - Режим доступа: https://www.newscientist.com/article/2323560-polystyrene-eating-beetle-larvae-could-help-us-recycle-plastics/

Приложения

1.1 1.2